肝癌干细胞新型培养体系的建立以及治疗靶点筛选道

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1、ewcuIturingsystemforliverrstemce11sandtherapeutictscreening研究生：黎江指导悬师：钱其军教授肿瘤学培养单位：第二军医大学东方肝胆外科医院户第■军医大学博士学位论文肝癌干细胞新型培养体系的建立以及治疗靶点筛选Ncancetarge专业名称：第二军医大学东方肝胆外科医院2012年5月FillfPPIIII)JIIIllIllffJIfY2111022独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文屮不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的

2、同志对木研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：凳江日期.2012年荫如学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。木人授权第二军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。学位论文作者签名：乡睽卢导师签名：日期：汐位年上月专D日日期：劫D年朔吾稠目录摘要A

3、bstract000Oo1•11SIJ舌"一“o缩略词表0前言……11第一章人肝癌干细胞样细胞的新型培养基的筛选及肿瘤细胞系的建业C“.6“£““6“心“2，727—、”““““““““””””””“”“实验器材27二、实验方法及步骤32三、结果与分析0B000043四、讨论…・・・Oooo0067第二章肝癌干细胞样细胞的深度测序以及生物信息学分析72—、研究背景72二、研究方法73三、数据结果与分析…0OOOOIQ0075四、讨｛仑…一n.”.90综述一肿瘤干细胞及肝癌干细胞研究现状93综述二Anoverviewofmechanismsresponsiblefor

4、tumordormancyo•104在读期间发表论文和参加科研工作情况说明119致说扌.・.000000...00000000000I000006000000000000000121肝癌干细胞新型培养体系的建立及治疗靶点的筛选丰两雾JI—,—习、肿瘤干细胞的存在已经被越来越多的人所认同，但由于分离到的cSCs细胞数量太少，难以支持后续实验的开展。如何在体外有效的分离，培养，扩増肿瘤干细胞,并以此为研究对象是我们思考的方向。国外学者在长期研究中发现，加入EGF和bFGF的无血清培养液有利于正常成体干细胞的体外扩增，并维持干细胞多向分化潜能。目前已经在乳腺癌、恶性神经系

5、统肿瘤、结肠癌等恶性肿瘤中分离培养得到了类似肿瘤干细胞的一群细胞，他们是用含有EGF和bFGF的无血清培养体系维持增殖、分化潜能。我们将以此为基础进行肝癌干细胞的培养。由于现阶段分离肝癌干细胞还缺乏广谱的公认的标志物，且绝大多数分离工作均局限于肝癌细胞系，直接从人癌组织分离并培养肝癌干细胞尚无报道，严重阻碍了对肝癌干细胞的深入研究。本实验采用直接无血清培养的方法，从肝癌细胞株以及人原代肝癌组织中分离岀肝癌干细胞样细胞并连续传代并尝试建立一种可有效富集肝癌干细胞样细胞的体外无血清悬浮培养技术，以期建立一种从人肝癌组织屮分离培养获得肿瘤干细胞样细胞的新方法。并对培养出的

6、球状细胞进行体外侵袭性，细胞周期的变化，细胞耐药性,克隆细胞的体外分化能力以及成瘤能力等方面验证我们获得的细胞具有肿瘤干细胞特性；进一步进行RNA深度测序和生物信息学分析，检测肝癌干细胞与肝癌细胞之间的差异。1、人肝癌干细胞样细胞的新型培养基的筛选及肿瘤细胞系的建立为更好的培养扩增肝癌干细胞，我们对培养体系进行优化，经过实验室长期的实验探索，筛选出7种有效的培养体系。培养成分包括DMEM.F12,非必需氨基酸，血清替代物，N2,B27,B27・minusVA,BSA,EGF,bFGF以及我们自己筛选的2个细胞因子IGF・1和FGF・10。通过长期的筛选实验证实C3号

7、培养配方是我们的最佳培养体系。这个配方包含了B27.minusVA,EGF和我们筛选的IGF.1和FGF.10。利用无血清C3培养基对肝癌细胞系、原代细胞系及异种移植技术得到的肿瘤组织等多种来源的细胞进行培养，并获得了球状细胞。从肝癌细胞系Hep3B和Huh7屮培养出來的球状细胞Hep3E—C、Huh7-C克隆形态越來越明显，并且能够稳定传代培养。从高侵袭性的细胞株HCCLM3和MHCC97・H及低侵袭能力的细胞株MIICC97-L分别培养得到了IICCLM3—C、MIICC97.H.C和MHCC97・L・C。在肝癌细胞系中成功得到球状生长的细胞之后，我们取病人