肝癌干细胞新型培养体系的建立以及治疗靶点筛选

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1、第二军医大学博士学位论文肝癌干细胞新型培养体系的建立以及治疗靶点筛选姓名：黎江申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：钱其军201205肝癌干细胞新型培养体系的建立及治疗靶点的筛选手葡姜肿瘤干细胞的存在已经被越来越多的人所认同，但由于分离到的CSCs细胞数量太少，难以支持后续实验的开展。如何在体外有效的分离，培养，扩增肿瘤干细胞，并以此为研究对象是我们思考的方向。国外学者在长期研究中发现，加入EGF和bFGF的无血清培养液有利于正常成体干细胞的体外扩增，并维持干细胞多向分化潜能。目前已经在乳腺癌、恶性神经系统肿瘤、结肠癌等恶性肿

2、瘤中分离培养得到了类似肿瘤干细胞的一群细胞，他们是用含有EGF和bFGF的无血清培养体系维持增殖、分化潜能。我们将以此为基础进行肝癌干细胞的培养。由于现阶段分离肝癌干细胞还缺乏广谱的公认的标志物，且绝大多数分离工作均局限于肝癌细胞系，直接从人癌组织分离并培养肝癌干细胞尚无报道，严重阻碍了对肝癌干细胞的深入研究。本实验采用直接无血清培养的方法，从肝癌细胞株以及人原代肝癌组织中分离出肝癌干细胞样细胞并连续传代并尝试建立一种可有效富集肝癌干细胞样细胞的体外无血清悬浮培养技术，以期建立一种从人肝癌组织中分离培养获得肿瘤干细胞样细胞的新方

3、法。并对培养出的球状细胞进行体外侵袭性，细胞周期的变化，细胞耐药性，克隆细胞的体外分化能力以及成瘤能力等方面验证我们获得的细胞具有肿瘤干细胞特性；进一步进行RNA深度测序和生物信息学分析，检测肝癌干细胞与肝癌细胞之间的差异。l、人肝癌干细胞样细胞的新型培养基的筛选及肿瘤细胞系的建立为更好的培养扩增肝癌干细胞，我们对培养体系进行优化，经过实验室长期的实验探索，筛选出7种有效的培养体系。培养成分包括DMEM．F12，非必需氨基酸，血清替代物，N2，B27，B27．minusVA，BSA，EGF，bFGF以及我们自己筛选的2个细胞因子

4、IGF．1和FGF．10。通过长期的筛选实验证实C3号培养配方是我们的最佳培养体系。这个配方包含了B27．minusVA，EGF和我们筛选的IGF．1和FGF．10。利用无血清C3培养基对肝癌细胞系、原代细胞系及异种移植技术得到的肿瘤组织等多种来源的细胞进行培养，并获得了球状细胞。从肝癌细胞系Hep3B和Huh7中培养出来的球状细胞Hep3B—C、Huh7-C克隆形态越来越明显，并且能够稳定传代培养。从高侵袭性的细胞株HCCLM3和MHCC97．H及低侵袭能力的细胞株MHCC97．L分别培养得到了HCCLM3．C、MHCC97．

5、H．C和MHCC97．L．C。在肝癌细胞系中成功得到球状生长的细胞之后，我们取病人的肿瘤组织直接进行消化培养，同样获得了球状细胞EHBH．HCSC—l和EHBH．HCSC．2细胞。同时，采用了异种移植技术，将病人的肿瘤组织直接包埋于小鼠皮下，一段时间后取小鼠的皮下肿瘤组织消化培养，分别利用常规的DMEM．F12+10％FBS和C3无血清培养体系进行第二军医大学博士学位论文培养，得到了一株呈上皮状生长的肿瘤细胞系EHBH一3和球状细胞EHBH．HCSC．3。2、球状细胞生物学特性分析经C3无血清培养体系获得了球状细胞后，进一步对这

6、些细胞进行了生物学特性的分析：1)利用实时荧光定量PCR检测Wnt一1，CD90，Ep．CAM，NOTCHl，NOTCH2，NOTCH3在Hep3B、Huh7、MHCC97-L、HCCLM3、Hep3B-C、Huh7一C、MHCC97．L．C、HCCLM3．C中的表达情况。结果表明CD90在球状细胞中表达量都高于其相对应的贴壁肝癌细胞株。其中，Huh7．C中CD90的表达量是Huh7中表达量的10倍。球状细胞与相对应的细胞株相比NOTCH的mRNA表达均下降，而在Wnt．1和Ep．CAM的mRNA表达水平上出现了不一致的现象。2

7、)对球状细胞进行糖原染色以及ICG的摄取实验，证实了这些细胞确实是肝癌细胞来源的细胞，而不是其他细胞污染。3)利用体外Matrigel侵袭实验直接比较Huh7细胞与Huh7．C细胞的侵袭能力。结果发现球状细胞Huh7．C与对应的Huh7细胞都具有较强的侵袭特性。定量分析结果表明，球状细胞Huh7一C的侵袭程度比Huh7高接近3倍。4)通过细胞周期的分析发现球状细胞Hep3B．C和Huh7．C主要处于GO．G1期，所占的百分比分别为74．09％和59．20％，与肝癌细胞株Hep3B和Huh7具有显著差异。5)流式细胞仪和RT-PC

8、R检测发现在球状细胞中CD90的表达量均有不同程度的提高，两次实验结果趋势一致。在Hep3B—C细胞中，其提高倍数达10倍以上，这与之前的研究者所获得的肝癌干细胞的表型一致。同时检测了细胞的表面抗原Ep．CAM的表达情况，结果发现两种球状细胞的表达量都是下降的，