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1、炙甘草药材指纹图谱探究［摘要］采用AgilentTC-C18(2)色谱柱(4.6mmX250mm,5um),以乙睛-水(含0.2%甲酸)为流动相梯度洗脱建立了炙甘草药材的HPLC指纹图谱，并采用HPLC-MS/MS对19个共有峰中的6个色谱峰进行了定性鉴别。采用该方法测定了10批不同产地的炙甘草药材，其相似度在0.72〜0.99。该方法精密度、稳定性和重复性良好，该研究为炙甘草药材的质量控制提供了参考。［关键词］炙甘草；HPLC；指纹图谱；质量控制［收稿日期］2014-02-11［基金项目］国家'‘重大新药创制”科技重大
2、专项(2011ZX09201-201-13,2012ZX09301003-001-004,2013ZX09508-105)［通信作者］乔善义，研究员，硕士生导师，研究方向为中药活性成分及质量控制，Tel:(010)66930634,E-mail：crbj611202@sina.com［作者简介］孙磊，实验师，Tel:(010)66930634,E-mail：rubyslsl@126・com甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎除去杂质、洗净、润透并干燥的炮制品，炙甘草是生甘草
3、按照蜜炙法炒至黄色至深黄色的炮制品［1］。甘草素有“十方九草”之谓，具有清热解毒，补气益脾胃，润肺祛痰，缓急止痛，调和诸药的作用［2］,而炙甘草虽基原与甘草相同，但经炮制后，其性味功效也有区别，炙甘草具有补脾和胃、益气复脉的功效，与生品相比增强了补脾益气的作用［3］。中药化学成分指纹图谱是指中药材或中成药经适当的前处理后，采用一定的分析手段得到的能够标志该中药材或中成药特征的色谱图或光谱图。现行炙甘草药材的质量标准，仅测定甘草昔和甘草酸这2个指标成分的含量，往往不能全面的反应炙甘草的质量，指纹图谱技术从中药药效来自多种化
4、学物质综合作用的观点出发，与测定单一组分相比，能够提供更丰富、有效的质量信息，因此指纹图谱技术可以更客观、科学、合理地进行中药质量控制。本课题组对中药经典方剂小柴胡汤的指纹图谱进行了系统研究［4-5］,炙甘草是小柴胡汤方剂的重要组成部分，对各单味药材的HPLC指纹图谱进行研究是实现对中药方剂全面质量控制的重要环节。对于炙甘草药材的指纹图谱研究，已有部分文献进行了报道［3,6］,但对于炙甘草指纹图谱中共有峰的定性鉴别,尚未见相关报道，本文采用HPLC,建立了炙甘草药材的高效液相色谱指纹图谱，同时采用HPLC-MS/MS方法
5、对部分色谱峰进行了指认，为炙甘草指纹图谱中的成分确认及其质量控制提供了参考。1材料日立L-2000高效液相色谱仪；Agilent6330离子阱质谱仪，配有Agilent1100液相色谱仪；北京长风HW-SY-K4型智能电热恒温水浴锅；KQ2200E型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；东京理化N-1001D-WA旋转蒸发仪；Sartorius-BS124S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；安徽科大中佳SC-3614型离心机。水为娃哈哈纯净水；乙惰和甲醇均为色谱纯；其余试剂为分析纯。10批不同来源炙甘草见表1。2方法
6、与结果2.1对照品溶液制备称取上述G1〜G10号炙甘草样品各10g,加入10倍量蒸馆水回流提取2次，每次2h,过滤，合并2次滤液。将滤液浓缩至1mL药液相当于6g生药，加入适量无水乙醇,至溶液中乙醇质量分数为70%,均匀搅拌，静置过夜，离心(25min,2500r•min-1),用70%乙醇洗涤沉淀,离心(25min,2500r•min-1),合并上清，浓缩除去乙醇，将得到的提取物70°C真空干燥，得到炙甘草样品。精密称取上述样品0.0300g,用50%色谱纯甲醇定容至10mL量瓶中，0.45um微孔滤膜过滤，得到炙甘草
7、供试品溶液，进行HPLC分析。2.2色谱条件色谱柱为AgilentTC-C18(2)色谱柱(4.6mmX250mm,5um)；以乙月青(A)-水(B,含0.2%甲酸)为流动相，梯度洗脱，见表2；流速1.0mL•min-1；检测波长265nm；柱温35°C；进样量20uLo2.3质谱条件离子源为ESI源，负离子扫描模式，雾化气压力为2.7X105Pa,干燥气流量为10.0L•min-1,离子源温度为350°C,碎裂电压1。梯度洗脱程序同2.2。2.4指纹图谱的建立与共有指纹峰的指认2.4.1指纹图谱的建立取2.1项制备的供
8、试品溶液各20UL,按照2.2项所述条件下进行测定，得到10批不同来源炙甘草HPLC指纹图谱，根据色谱图中各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰，并选取其中19个特征色谱峰，建立的HPLC共有模式图见图lo2.4.2共有指纹峰的指认为进一步阐明炙甘草的化学组成，采用HPLC-MS/MS技术并结合文献，对HPLC指纹图谱1
