钝顶螺旋藻sp-ch32藻胆蛋白的高效表达特性及制备工艺研究

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1、浙江大学硕士学位论文钝顶螺旋藻Sp-CH32藻胆蛋白的高效表达特性及制备工艺研究姓名：刘艳辉申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：汪志平20050601摘要螺旋藻是丝状的多细胞蓝藻，是当前国内外研究与开发规模最大的经济微藻。藻胆蛋白是螺旋藻中含有藻胆素、具有荧光特性的一类生理活性蛋白，具有很高的理论研究与开发利用价值。藻胆蛋白不仅可作为天然色素用于食品、化妆品和染料等行业，而且因其具有提高机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老和防治贫血等功效而广泛用于医药保健领域。同时，利用其特有的光化学活性制成的荧光分子探针和光敏剂，在临床医学诊断、免疫化学、生物

2、工程及肿瘤激光治疗等领域也有很好的应用前景。为筛选到能应用于生产实际的高产藻蓝蛋白的钝顶螺旋藻优良新品系，我们对Sp—S、Sp—T、Sp-YEl5：,Sp-CH32、Sp—HUF01、Sp—IDF和Sp—YC09这7株在分类学上有代表性、且在养殖生产中表现优良的钝顶螺旋藻品系的光合色素作了较系统的比较研究。结果发现，Sp—CH32的叶绿素和类胡萝h素与其它螺旋藻株的相当，而藻胆蛋白含量高达细胞干重的29．994％，比上述其它6株中最高者sp—s的高20．9％，比上述7株螺旋藻藻胆蛋白含量的平均值高36．9％。进一步测得取自工厂化养殖中6个生产批次Sp—

3、CH32的藻胆蛋白含量在29．872---35．821％之间，平均含量为32．412％。从而表明，Sp-CH32在实验室和大规模养殖中均具有稳定、高效表达藻胆蛋白的优良特性。针对Sp—CH32藻胆蛋白的含量高、细胞较其它藻株易于破碎等特点，我们在总结前人工作的基础上，通过研究建立了Sp—CH32藻胆蛋白的制备工艺，并对纯化出的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的光谱特性等作了研究。藻体细胞经冻融破碎，所得粗提液经(NH。)：sO。沉淀所得45％～50％饱和度的级份，直接上SephacrylS-200凝胶过滤层析柱，不仅使藻胆蛋白的纯度值提高到3左右，还去除TfNH4

4、Ls04，省去繁琐、I耗时的透析脱盐过程。进而在比较了QSepharoseFastFlow、DEAE52和羟基磷灰石(HA)三种离子交换层析柱纯化效果的基础上，确定HA对藻胆蛋白的纯化效果最好，优化后的制备工艺能同时纯化出纯度值均大于4．O的高纯PC和APC，且两者之和达细胞干重的15．767％，从粗提液到试剂级纯品的藻胆蛋白得率高达52．57％。同时，我们还根据在储运和使用中选择产品剂型等实际需要，对高纯Sp．CH32藻蓝蛋白(Pc)和别藻蓝蛋[h(AFC)在溶液状态与冻干粉状态下的稳定性，作了较系统的比较研究。结果表明，PC和APC溶液在60。C或

5、70。C时处理10min即变性；在4℃、30。C或45。C时即使调整溶液的pH值也不稳定：只有在．20。C呈冰冻状态时，才能保持长期稳定。而将PC和APC经冷冻干燥制成冻干粉后，它们稳定性均得到了显著提高，能满足储存、运输和使用等实际需要。IIAbstractSpirulinaplatensisismulti-cellfilamen．tousblue—greenalga,simultaneously,itisalleconomicmicroalgawiththelargestscaleofresearchandexploitureinlandandab

6、road．Thephycobiliproteinsarekindsofactiveproteinwhichextensivelyexistsinspirulina，anditbearsphycobilinwithfluorescenceidiosyncrasy,SOthephycobiliproteinspossessesgreatvaluesintheoryresearchaswellasexploiture．Thephycobiliproteinscallnotonlybeusedasnaturalpigmentsinfood，cosmetican

7、ddyeindustries，butalsobeappliedtotheareaofmedicamentsandhealthyfoodssinceitcallimproveimrnanecapabilityandresistt=11lnour，radiation，caducity，anaemiaandSOon．Inaddition，asfluorescencemolecularprobeandphotosensitivereagent，ithasfineprospectinclinicaldiagnoses，immunochemistry,bioeng

8、ineeringandtumorlasertherapy．Inordertoscreenout