钝顶螺旋藻蛋白质组学及代谢途径研究

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1、’3．、◆，'’■l鼍-’1▲'▲目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．72材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯．82．1基因组随机文库的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．82．2基因组序列拼接与注释⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．102．3钝顶螺旋藻总蛋白的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．112．4SDS．PAGE凝胶电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122．5双向凝胶图像分析及

2、MALDI．TOFMS蛋白鉴定⋯⋯⋯⋯⋯133结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．143．1钝顶螺旋藻基因组分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．143．2二向蛋白电泳及蛋白鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163．3差异表达蛋白及其代谢途径分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．174分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯254．1糖酵解途径和糖异生途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯254．2戊糖磷酸途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯_⋯⋯⋯⋯274．3光合作用及C02的固定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．284．4蛋白翻译后修饰⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．304．5脂类合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．／⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯304．6胞外被膜的生物合成及分泌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯314．7氨基酸生物合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。314．8核苷酸代谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯314．9辅助因子⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯324．10其他蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．325小结与展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．33参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯．j⋯．．39致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．40综五匕⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41学位论文独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56温州医学院硕士学位论文不同光照条件下钝顶螺旋藻蛋白质组学及代谢途径研究中文摘要【目的】本项研究在完成的钝顶螺旋藻全基因组测序的基础上，利用蛋白组学技术(2D．PAGE和MALDI．TOFMS技术)，进行钝顶螺旋藻不同光照条件下的蛋白表达谱分析，探索钝顶螺旋藻对外界光条件的响应。运用比较蛋白组学分析蛋白表达的差异，追踪并进一步鉴定这些差异蛋白，

5、且定位到基因组相应的ORF上，寻找出一些重要ORF的功能信息。另外，我们将追踪这些差异蛋白在胁迫环境下是如何协调各自的代谢调控网络，将有助于拓展对蓝藻的蛋白组学和系统生物学的研究。本研究将为后续的研究奠定了基础，即利用集胞藻PCC6803作为蓝细菌遗传转化系统的模式生物，进行差异表达蛋白的功能验证，进而研究螺旋藻代谢途径调控网络的分子基础。【方法】对已完成的钝顶螺旋藻基因组用Glimmer3．02进行ORF预测，根据序列相似性进行功能注释，并根据COG进行蛋白分类及功能研究。分别提取光照和黑暗条件下培养的钝顶螺旋藻总蛋白，经2D．PAGE分离出各蛋白组分，银染后，进行UNAXPower

6、look2100XL扫描仪获得图像，利用ImageMaster2Dplatinum5．0程序分析找出差异表达蛋白点。通过显著性分析，我们挑选出重复性好的蛋白点进行胰酶消化，MALDI．TOF质谱仪分析。肽指纹图谱通过软件FlexAnalysiS2．4和BrukerDaltonicsBioTools3．0连接到MascotNCBInr数据库进行比对分析，对所鉴定的蛋白根据COG进行功能分类，并通过KEGGKAAS将其定位到各自的代谢途径上，进行表达调控研究。【结果】1．成功构建30．40kb大小的fosmid文库，进行末端测序，获得7175条reads，经Phred／Phrap序列拼接，

7、solexa测序，以及PCR测序延伸，形成11组大Scaffolds，涵盖整个基因组达6．82Mb。2．利用Glimmer3．02预测了5713个ORF，并做相似性比对，结果发现有5210个ORF与己知基因有不同程度的相似性，且这些ORF中有88．2％(4595／5210)与极大节旋藻(ArthrospiramaximaCS．328)基因非常相似，表明两者亲缘关系密切。为把这些预测的基因进行功能分类，COG比对结果发现可以对3602个基因(63