病原诱导的小麦转录因子tapimp1基因的特性及功能研究

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1、SichuanAgriculturalUniversityPh．M．DISSERTATIoNCharacterizationandfunctionalanalysisofpathogen--inducedMYBtranscriptionfactorgeneshPIMPlinwheatPh．M．Candidate：ZhouXianyaoSupervisor：Prof．ZhangHuaiyuProLZhangZengyanDiscipline：BiophysicsResearchField：MolecularBiophys

2、icsAgriculturalUniversityYa’an625014，SichuanMay,2010论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：发翘i“9年勺A妇＆关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业入学

3、有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。～躲，司-饭粗⋯和形叼、．a◇Io辱与A≥≥El≥矽io年5其彦aB摘要近年来，随着生态环境的不断变化，我国的小麦生产正遭受日益严重的疾病侵害，同时也受到极端气候的影响。特别是小麦纹枯病、根腐病等病害，以及干旱、寒冷等极端天气都对我国小麦生产造成了严重的危害。本文以病原诱导的

4、小麦MYB转录因子基因为研究对象，对其表达特性、转录因子部分性质以及在转基因烟草和转基因小麦中的功能进行了初步研究。本论文取得以下结果：1．初步明确了TaPIMPl基因的表达特性。荧光定量PCR结果表明，用小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)和纹枯病菌(Rhizotoniacerealis)对小麦叶片进行接种后，在叶片中TaPIMPJ的表达量都相对提高，并且对小麦根腐菌的反应相对于纹枯菌的较为迅速。在根腐菌接种6h的时候TaPIMPJ表达上调3倍，在48h时该基因表达量最高、上调了1l倍。而在对纹枯

5、病菌的反应中，TaPIMPl的表达量在纹枯病菌接种12h时达到表达高峰，表达量上调3倍。用防卫相关植物激素水杨酸SA、茉莉酸JA、乙烯ET和脱落酸ABA对小麦叶片进行处理，研究这些激素是否诱导小麦叶片中TaPIMPJ的转录表达。结果表明，只有脱落酸ABA对该基因表达的诱导作用明显。2．明确了TaPIMPl蛋白具有核定位的特性，优化了TaPIMPl蛋白的原核表达和纯化条件。构建了TaPIMPl．GFP融合蛋白载体，并用基因枪将该载体打入洋葱表皮细胞，暗培养后观察表达的融合蛋白在细胞中的定位。实验结果表明，TaPIMPl．

6、GFP融合蛋白集中分布在细胞核中，而对照GFP在细胞核和细胞质中均有分布，证明了TaPIMPl具有核定位的特性；为研究TaPIMPl蛋白的体外生化性质，构建了TaPIMPl．GST融合蛋白的原核表达载体，并将该载体转化到大肠杆菌BL21中，对其进行诱导表达实验。在原核表达的实验中，0．1mMIPTG的诱导浓度、16℃的诱导温度以及12h诱导时间，是TaPIMPl．GST融合蛋白表达的合适条件，能较好地避免包涵体的形成。3．明确了TaPIMPl基因在转基因烟草中的抗病和抗逆功能。通过卡那霉素抗性筛选以及PCR分子检测，筛

7、选到转TaPIMPJ『基因阳性的烟草植株，通过半定量RT-PCR进一步分析，获得一些过表达的转基因烟草植株。通过对转基因烟草的叶片进行青枯病菌接种，结果表明，过表达的转基因烟草叶片对青枯病有非常明显的抗性。对转TaPIMPl基因烟草及其转基因烟草受体的叶片进行模拟脱水(20％PEG6000溶液)、高盐(100mMNaCI溶液)以及氧化还原(3009M甲基紫精)处理，结果表明过表达的转基因烟草叶片有较好的抗旱、抗盐以及抗氧化还原效果。通过对烟草植株进行干旱和高盐处理，发现与野生型烟草W38相比，转TaPIMPl基因烟草的

8、部分株系对干旱和盐处理具有良好的抗性。表明过表达的转基因烟草植株也具有较强的抗旱和抗盐效果。对部分转基因株系以及野生型烟草W38的叶片进行总蛋白提取，测定其生理活性，结果表明，相对于野生型烟草，转基因株系的苯丙氨酸解氨酶活性和SOD活性明显提高。4．通过对转TaPIMPl基因小麦的分子检测和抗病性分析，初步明确了TaPIMPl过表