褶纹冠蚌hmgb1和组蛋白抗菌肽的表达及hmgb1的致炎功能

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1、南昌大学硕士学位论文褶纹冠蚌HMGB1和组蛋白抗菌肽的表达及HMGB1的致炎功能姓名：李琰申请学位级别：硕士专业：水产养殖指导教师：文春根20120606摘要褶纹冠蚌(Cristariaplicata)分布广泛，是我国重要的淡水育珠蚌之一，具有一定的经济价值。高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupboxl，HMGBl)是一种细胞核的蛋白，在细胞内有多种作用。本文利用RT-PCR，克隆出褶纹冠蚌HMGBlcDNA全长。褶纹冠蚌HMGBlcDNA全长621bp，编码207个氨基酸，预测编码的蛋白分子量大小为24KDa，预

2、测等电点PI=5．7。本文还将基因扩增产物和表达载体pET-30a经KpnI、EcoRI双酶切之后，连接并构建重组表达质粒，将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta—gami(DE3)中，OD600=0．65时加入IPTG至终浓度为lmmol／L，37℃诱导12h，得到大量可溶性蛋白，用Ni2+亲和层析镍柱纯化，最终得到较纯的目的蛋白。通过向SD／J,鼠注射rCpHMGBl，使SDd,鼠血清中的TNF．Q含量出现明显上升，在4h处出现峰值，并随着rCpHMGBl浓度的上升，TNF—Q的浓度上升。说明了重组的褶纹冠蚌rHMGBl具有使小鼠

3、致炎的能力。组蛋白H2A(HistoneH2A)是一种富含赖氨酸的组蛋白。本文利用RT-PCR等分子生物学技术，克隆出褶纹冠蚌组蛋白H2AN末端多肽cDNA。其全长120bp，编码39个氨基酸，预测编码的蛋白分子量大小为4．0KDa，预测等电点PI=12．3。本文将基因扩增产物和表达载体pET-30a和pET-32a经KpnI、EcoRI双酶切之后，连接并构建重组表达质粒，将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta．gami(DE3)中，加入IPTG至终浓度为lmmol／L，37℃诱导8h，得到大量目的蛋白。关键词：褶纹冠蚌，高迁移率族蛋

4、白Bl，组蛋白抗菌肽，表达，纯化，致炎功能AbstactAbstractThefreshwatermusselCristariaplicata，whichisofgreateconomicalimportanceandknownas“pearlbivalves”intheaquacultureindustryofChina，Widelyrespectively,havecertaineconomicvalue．Highmobilityisakindofnuclearproteinwhichhasmanyfunctionsincell

5、s．Inthepresentstudy，theHMGB1cDNAofthefreshwatermusselCristariaplicatawasclonedusingtheRT·PCRtechnique．TheCpHMGBIis621nucletides(nt)inlengthandencoding207aminoacidresidues，andthemolecularweightofthepredicetedHMGB1is24KDawiththecalculatedPIbeing5．7．Furthermore，theDNAprod

6、uctsandvectorpET一30aweredigestedbytherpnI、EcoRIenmyzes，andthenligated．TherecombinantplasmidsweretransformedintotheprokaryoticcellRosetta—gami(DE3)andinducedwithIPTGwhentheOD600being0．65at37。Cfor12h，andthenwaspurifiedbyusingthenativeNi2+affinitychromatography．Finally,ob

7、tainedthepurposeofthanpureprotein．ThelevelsofSDmiceserumTNF—QwererasiedafterbeinjectedbyrCpHMGB1，themaximumsecretionwasobseverdat4hlater,andasrCpHMGB1concentrationrises．themeasurementofTNF．Qincreased。Itshowsthe·rCpHMGB1havepro—inflammationcapacityinSDmice．HistoneH2Aisa

8、richblendoflysineofprotein．Inthepresentstudy，theHistoneH2AN—terminalpeptidecDNAofthefreshwatermusselCristariaplicataw