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1、褶纹冠蚌论文：褶纹冠蚌过氧化氢酶基因克隆、原核表达及酶活性分析【中文摘要】褶纹冠蚌(Cristariaplicata)是我国重要“淡水育珠蚌”之一,近年来褶纹冠蚌频繁受到病害的影响,对其育珠能力产生了极大的影响。本文对褶纹冠蚌过氧化氢酶(cpCAT)的cDNA进行了克隆与原核表达。本文利用RACE-PCR及同源克隆方法,克隆出cpCATcDNA全长。该基因全长为4863bp,且有3个外显子,2个内含子。cpCATcDNA全长为2618bp,其中编码区1503bp,5’端不翻译区136bp,3’端不翻译区979bp
2、,具有典型的腺苷酸信号序列AATAAA和PolyA尾。该基因序列开放阅读框编码为501个氨基酸,预测蛋白质分子量为56.86kDa,等电点为6.77。BLAST分析显示cpCAT氨基酸序列和动物,植物,细菌的CAT基因有很高的同源性。cpCAT无信号肽,存在过氧化氢酶近端活性位点(61FNRERIPERVVHAKGAG77)和过氧化氢酶近端血红素配体签名序列(351RLYSYSDTH359),两个糖基化位点(145NNTP148)与(436NFSQ439)。系统发育树结果表明褶纹冠蚌与栉孔扇贝(Chlamysfa
3、rreri)过氧化氢酶基因的亲缘关系最近。利用RT-PCR分析检测cpCAT基因经注射嗜水气单胞菌后的表达情况,结果表明在注射嗜水气单胞菌后,在血液、鳃、外套膜、闭壳肌和肝脏中都有表达,且在肝脏中的表达量最高,且各个组织中cpCAT基因的表达明显增加,12h后达到最大值,随后表达有所下降,到48h后恢复至原有水平。结果表明褶纹冠蚌在受到病害后,其体内的过氧化氢酶具有防御作用。根据开放阅读框设计带酶切位点(KpnI和EcoRI)的引物,构建重组表达质粒,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE分析表达产物。结果表明
4、重组cpCAT在大肠杆菌(Escherichiacoli)Rosetta-gami(DE3)中获得了表达,产物为56.86KDa。纯化的cpCAT的酶活力可达11194.4+40.4U/mg,该酶最适温度为25℃,有较高的热稳定性(60℃以下),cpCAT的pH值的最适范围在pH5.0-10.0,最适pH值为7.0。用变性剂Urea和SDS处理时酶活性有所改变,用1%～3%SDS和2～4mol/LUrea处理时,酶活性保持80%以上。随着变性剂浓度的增加,cpCAT酶活力逐渐降低。【英文摘要】Cristariap
5、licalaisoneofthemostimportant“Freshwaterpearlmussel”inourcountry.ButrecentlyCristariaplicataisvulnerabletodiseasefrequently,whichmakesagreatinfluencetotheabilityofthepearl.ThecatalasecDNAofC.plicata(cpCAT)wasclonedandthefulllengthwasexpressedwithProkaryoticex
6、pressioninthepaper.ThecpCATcDNAfullsequencehasbeenclonedusinghomologouscloningandRACE-PCR.Thegeneis4863bplongandhasatotaloftwointronsandthreeexons.Inadditionthefull-lengthcDNAofcpCATcontained2618bp,ThecDNAcontaineda5’untranslatedregion(UTR)of136nucleotides,th
7、e3’UTRof979bpwithacanonicalpolyadenylationsignalsequenceAATAAAandapolyAtail,andanopenreadingframe(ORF)of1503bp,encoding501aminoacidresidueswith56.86kDapredictedmolecularweight.Thetheoreticalisoelectricpointwas6.77.BLASTanalysisshowedthatthededucedaminoacidseq
8、uenceofcpCAThadsignificanthomologytocatalasesfromanimals,plantsandbacteria.ThededucedaminoacidsequenceofcpCAThadcharacteristicfeaturesofcatalasefamilysuchascatalyticsitemotif(61FNRERIPERV
