mtor通路参与柯萨奇病毒b3诱导的hela细胞凋亡机制研究

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1、万方数据中图分类号R725．4．R34博士学位论文学校代码!Q§圣兰密级公珏mTOR通路参与柯萨奇病毒B3诱导的HeLa细胞凋亡机制研究TheresearchaboutmechanismofthemTORsignalingpathwaytakingpartintheCoxsackievirusB3一inducedapoptosisofHeLacells作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：李欣临床医学儿科学湘雅三医院杨作成教授论文答辩日期兰!竺!：：：答辩委员会主席中南大学二0一四年三月万方数据本课题获得以下

2、基金资助：国家自然科学基金项目(30973233)；中南大学2012年研究生自主创新课题(2012zzts035)；湘雅三医院重点学科建设资金(2010，66)IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIlY2688784万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中

3、作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：!§兰日期：生年上月丛日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：A期：鱼壁年三月坐日导师签名绨易r总文日期：塑年上月兰IEI万方数据mTOR通路参与柯萨奇

4、病毒B3诱导的HeLa坌m胞凋亡机制研究摘要目的：分别通过mTOR和P13K抑制剂干预以及基因转染技术建立mTOR及相关通路抑制和其下游分子过表达后CVB3感染HeLa细胞模型，观察CVB3诱导产生细胞病变效应(CPE)和凋亡情况及CVB3复制、凋亡相关分子的变化，以探讨P13豳，AWmTOR信号通路在CVB3感染后导致的细胞凋亡中的作用。方法：首先，选用人宫颈癌细胞株(HeLa)建立经典CVB3感染细胞模型，分别用mTOR抑制剂一雷帕霉素及P13K抑制剂一LY294002对模型进行干预，采用流式细胞仪技术检测细胞凋亡率，半定

5、量PCR，WesternBlot检测细胞凋亡因子Bim、Bax、Caspase．9、Caspase．3及CVB3表达变化；其次，通过细胞稳定转染技术分别构建4EBPl、p70S6K、Aktl和Akt2过表达HeLa细胞系，建立CVB3感染细胞模型，采用流式细胞仪技术检测细胞凋亡率，Real．timePCR和westemBlot检测细胞凋亡因子Bim、Bax、Caspase．9、Caspase一3及CVB3表达变化，免疫荧光及细胞电镜技术检测病毒复制情况。最后应用SPSSl6．0统计软件对数据进行统计分析，P

6、统计学意义。结果：(1)雷帕霉素、LY294002均可抑常lJHeLa细胞活性，并呈浓度依赖效应；(2)雷帕霉素、LY294002对CVB3复制的作用不同但均可促进CVB3诱导的细胞凋亡；(3)雷帕霉素和LY294002可阻断CVB3对Bim活性的抑制作用，进一步促进CVB3诱导的Bax活化；(4)雷帕霉素和LY294002促进CVB3诱导的Caspase．9活化，同时促进Caspase．3的自我裂解，以启动Caspase级联反应；(5)空质粒过表达细胞株建立后，以正常HeLa细胞作为对照组进行WesternBloting验证

7、，pcDNA3．1．myc．HisA(．)质粒转染组可见myc标签蛋白的表达；(6)不同基因过表达细胞株建立后，提取细胞总蛋白，以正常HeLa细胞及稳定表达空质粒HeLa细胞为对照组进行WestemBlotinglI万方数据验证，可见质粒转染组分别可见4EBPl、p70S6K、Aktl和转基因A1【t2表达明显增高；(7)过表达4EBP1、p70S6K、Aktl或Akt2可促进CVB3诱导的细胞凋亡和细胞病变效应；(8)过表达p70S6K、Aktl或Akt2可促进CVB3mRNA合成而抑制VPl表达，过表达4EBPl贝,1]抑

8、制CVB3mRNA合成而促进VPl表达；(9)CVB3诱导的Bim矛HBax的表达可被过表达4EBPl、p70S6K抑制，同时可被过表达Akt进一步活化；(10)CVB3诱导的Procaspase．9、Caspase．3自我裂解可被过表达4EBPl、p70S6K激活，同时被被