探讨肿瘤转移抑制基因tmsg-1蛋白转录新功能

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1、探讨肿瘤转移抑制基因TMSG-1蛋白转录新功能摘要目的肿瘤转移抑制基因TMSG一1的肿瘤转移抑制和神经酰胺合成功能方面已经做过大量研究，但其转录功能研究甚少。本研究通过构建含有TMSG．1蛋白不同功能域的真核重组质粒并观察各重组质粒在亚细胞的定位，以确定基因内部的核定位信号，探索TMSG．1蛋白作为转录因子的新功能。方法以TMSG．1真核表达载体为模板，聚合酶链式反应(PCR)扩增TMSG一1基因全长和不同截断体片段，与带有Flag标签的真核表达载体pcDNA3连接，转化感受态细胞DH5a，经氨苄青霉素筛选阳性克隆，菌液提取质进行粒酶切初步鉴定，后由上海生物工程公司测序

2、鉴定。将序列正确的各重组质粒转染Hela细胞，Westernbloting鉴定蛋白表达。免疫荧光检测各个截断体亚细胞定位。通过TMSG一1基因结构分析，对预测的核定位序列进行缺失研究，构建QST5重组质粒并观察亚细胞定位改变。结果PCR成功扩增得到目的基因片段，并构建得到TMSG一1全长及不同截断片段Tl(aal29一aa380)、T．2(aa71-aa380)、T3(aal-aal28)、T4(aal—aa70、、T5(aa71一aal28)矛u核定位信号缺失体QST5(aa71．aal18)的真核表达质粒，经酶切初步鉴定及基因测序鉴定，各重组质粒基因序列全部『F确，

3、Westernbloting检测结果表明各重组的真核表达载体均有预期长度的蛋白表达。免疫荧光结果表明，含有Homeodomain结构域的截断体T2、T3及T5能够入核，其中T2在核内弥漫分布，而T3及T5主要定位于细胞核的核仁部位，缺失预测核定位信号(NLS)序列的QST5仍定位于细胞核，但其荧光信号不集中在核仁。不含Homeodomain结构域的TI$11T4定位于细胞浆。结论成功构建TMSG．1全长及不同截断片段的真核表达载体并成功表达，确定TMSG．1蛋白含有Homeodomain结构域的截断体能够入核，而缺失Homeodomain结构域中预测的核定位序列的截断体

4、能定位于细胞核，却不再集中于核仁，初步确定其核定位信号很有可能为核仁定位信号，具有转录因子活性引导基因进入核仁，为研究TMSG—l蛋白转录功能奠定基础，并为肿瘤的基因治疗提供新的思路。．硕士研究生：夏岩(病理学)指导教师：项锋钢教授关键词：基因，肿瘤抑制；亚细胞定位；核定位信号；肿瘤转移Theinvestigationofthetranscriptionalnewfeatureoftumormetastasissuppressorgene1TMSG-1proteinAbstractObjectiveToinvestigatethetranscriptionalactiv

5、ityoftumormetastasissuppressorgene1(TMSG_1)proteinandidentifythenuclearlocalizationsignalofTMSG．1．weconstructed5truncatedeukaryoticexpressionvectorsofTMSG．1containingdifferentfunctionaldomainsofTMSG-1，andexploredthesubcellularlocalizationofdifferenttruncatedproteinsofTMSG-1．MethodsDiffer

6、entgenefragmentscontainingdifferentfunctionaldomainsofTMSG．1wereamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)usingpcDNA3．TMSG．1asthetemplate．ThegenefragmentswereconnectedwitheukaryoticexpressionvectorpcDNA3afterthefragmentswerecutbylimitedincisionenzymesandthentherecombinedvectorsweretransform

7、edtocompetentcellsDH5a．Thepositivecolonswereselectedbyampicillin。Thelimitedincisionenzymesandgenesequencingwereappliedtoidentifythecorrectrecombinedvectorswhichhadcorrectsequence．TheeukaryoticexpressionvectorswerethentransfectedintoHelacells．Theexpressionsofthesefusionpro