npm1突变基因经rasmapkerk信号通路调控白血病细胞体外侵袭

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1、重庆医科大学硕士学位论文NPM1突变基因经RAS/MAPK/ERK信号通路调控白血病细胞体外侵袭姓名：陈先春申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：张伶201205重庆医科大学硕士研究生学位论文删突变基因经RAS小AP姗RK信号通路调控白血病细胞体外侵袭摘要第一部分删突变基因调控白血病细胞MMPs和Ang水平核仁磷酸蛋白(刀甜c彪印办删砌，删J『)基因是急性髓系白血病中发生突变频率最高的基因，其基因突变参与调控白血病的发生和发展。临床上，发生艘^∥，基因突变的白血病患者多伴有髓外组织器官的浸润。为了深入探讨懈^彳』突变基因对白血病细胞浸润相关因子水平的调控作用，借助载体PINCO-n

2、ag-NPMlmA将艘膨7突变A型基因(删聊J『，删)转染THP．1白血病细胞，构建稳定表达NPMlmA突变蛋白的单克隆细胞株(THP．1mA)，同时设立空载组(PINCO)和未转染组(untreated)作为对照；利用体外侵袭实验分析删突变基因对白血病细胞侵袭力的影响；明胶酶谱法分析基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)MMP-2和MMP-9的活性；qRT-PCR检测血管生成素(angi叩oietins)彳馏一J『和4蟹2mIⅢA的表达水平。实验结果显示，与对照组比较，NPMlmA组的细胞侵袭力明显增强，l、心嗄P-2和MMP．9活性显著性增高，同时，

3、NPMlmA组细胞的彳懈一』mI矾A气重庆医科大学硕士研究生学位论文水平明显增高，而4，7争2mRNA表达量明显降低。本研究提示，Ⅳ尸M，突变基因可能通过增强MMP·2、MMP-9活性和4静』表达以及降低彳馏一2mRNA水平等途径，调控白血病细胞外基质降解和血管新生来增强白血病细胞的体外侵袭力。关键词：核仁磷酸蛋白；白血病细胞浸润；基质金属蛋白酶；血管生成素第二部分RAS／MAPl洫RK信号通路在删突变白血病细胞体外侵袭中的作用前期工作发现删，突变基因通过MMPs和Ang参与调控白血病细胞的浸润。为了进一步探讨信号转导通路在删』突变基因调控白血病细胞浸润的关键作用，采用免疫共沉淀技术分析NP

4、Ml突变蛋白和K．RAS蛋白的相互作用；利用RAS下游MAPKs和P13K相关信号通路相关抑制剂处理THP一1mA细胞，观察阻断信号通路后对细胞侵袭能力的影响；同时，用qImPCR检测脚一2、脚一9和4馏一J『、4馏一2mRNA的表达水平，Westemblot和明胶酶谱分别检测MMP．2、MMP．9蛋白的表达水平及蛋白酶的活性。结果发现，NPMl突变蛋白能与K-RAS蛋白相结合；EI水抑制剂(PD98059，40州)对THP-1mA细胞的侵袭具有明显的抑制作用(p

5、h后，细胞内MMP．2、MMP一9的mRNA和蛋白4重庆医科大学硕士研究生学位论文表达量明显降低；同时，分泌到胞外的MMP．9的蛋白酶活性也显著下降；此外4愕．J『和4门g-2mRNA表达水平增高。结果提示NPMl突变蛋白可通过RAS蛋白结合，主要通过RAS／MAPK／EI水信号通路，上调MMP．2和MMP．9的表达水平和蛋白酶活性，同时抑制彳蟹2表达，从而增强白血病的浸润能力。关键词：核仁磷酸蛋白；基质金属蛋白酶；血管生成素；RAS爪丌APK／FRK重庆医科大学硕士研宄生学位论文川P枷MUTATIoNSREGULATETHEINVASIVEPHENOTYPEVIARAS／MEK／ERKSI

6、GNALINGINHUⅣIANLEUKEMIACELLSjrⅣ”7RDABSTRACTPARTIMutatedD正PAj仃generegulatetheexpressionofmatrixmetaUoproteases(AⅣPs)andangiopoietins(Ang)Mutationsof力“c彪印办傩聊砌(MW，)genearethemost仔equentgeneticalterationi11acutemyeloidleukeIIlia，whichwereinvolvedi11leukemogenesis．Thepatientswimmutated脚MJ『厅equentlyconta

7、inextramedullaWinfiltration．Tbexploremee仃ectofmutatedⅣPM，geneontheeXpressionofmatrixmetalloproteases(MMPs)aJldan百opoietins(Ang)thatassOciatedwithleukemiainVasiOn．PINC0一nag—NPMlmAVectorwimNPMlmutantAgene(NPM