永生化大鼠牙囊细胞系成骨特性的初步研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文永生化大鼠牙囊细胞系成骨特性的初步研究姓名：郑鸿申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学指导教师：宋锦璘201205永生化大鼠牙囊细胞系成骨特性的初步研究摘要牙周病是指发生在牙周软硬组织上的慢性、非特异性、感染性疾病。根据程度不同，其临床表现及治疗方法各异。其主要表现为牙龈炎症、出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收甚至牙齿松动脱落。对严重的牙周病，最后常需通过修复手段，如植骨术或引导组织再生术(Guidedtissueregeneration，GTR)重建已丧失的牙周组织，形成新的牙周组织和新附着。目前利用在牙周缺损处局部移植骨髓干细胞、

2、牙周韧带细胞、牙囊细胞等促进牙槽骨再生的牙周组织工程研究较多。牙囊细胞(dentalfolliclecells，DFCS)来源于牙囊，是一组具有多种生物学功能和分化潜能的多能干细胞，是牙周组织工程的种子细胞之一。可分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞及未分化间充质细胞形成牙周组织，在牙周病治疗中起原始生成的作用。牙周病治疗最关键的是形成新的牙槽骨，通过DFCS在牙周缺损区的成骨分化作用，增加骨量形成牙周病的硬组织基础，在牙周修复中具有很大一部分的作用。牙囊细胞体外培养易丧失自我更新能力、发生老化，且纯化非项目资助：1．国家自然科学基金面上项目：基

3、于牙周组织工程技术的低强度脉冲超声波促进牙病组织修复作用研究(N0．30870754)。2．重庆市教委第二批优秀专业技术人才资助计划：渝教人20101721构建永生化人牙囊细胞系应用于牙周组织再生的实验研究常困难，难以实现大量扩增，制约了其在牙周组织工程中的研究应用。1989年Cbud等首次将体细胞永生化并保持了原细胞的特性且未产生癌变倾向。永生化指体外培养的细胞经过自发的或外界干扰而避免增殖衰老，具备无限增殖能力的过程。本实验研究大鼠牙囊细胞的永生化方法及其永生化后的成骨特性，为后期相关实验提供足够数量的牙囊细胞。目的：1．拟将外源性SV40T-A

4、g病毒转染至体外培养的大鼠牙囊细胞中，建立永生化的大鼠牙囊细胞系。2．观察永生化大鼠牙囊细胞的生物学特性及其成骨分化的潜能。3．为后续的牙周组织工程研究提供充足的大鼠牙囊细胞。方法：1．组织块法及酶消化法相结合培养原代大鼠牙囊细胞，通过差数贴壁法传代分离纯化大鼠牙囊细胞，进行形态学观察(光镜)、细胞组织学来源鉴定、绘制细胞生长曲线，为下一步永生化提供实验细胞。2．采用第3或4代大鼠牙囊细胞，利用293细胞包装病毒构建含SV40T-Ag的逆转录病毒载体，制备重组逆转录病毒并转染大鼠牙囊细胞，建立永生化的大鼠牙囊细胞系。3．Real．timePCR检测S

5、V40T-Ag病毒在实验组大鼠牙囊细胞基因中的整合情况。44．WestenBlot分析实验组大鼠牙囊细胞端粒酶长度5．实验组大鼠牙囊细胞成骨特性分析(ALP、OC、BMP2、nmx2)。6．实验组大鼠牙囊细胞生长曲线和增殖特征观察。7．实验组大鼠牙囊细胞克隆形成能力检测。结果：1．成功培养出大鼠牙囊细胞，其形态及生长均与文献报道相近，组织学鉴定细胞来源于外胚层。2．成功构建含SV40T-

6、Ag的逆转录病毒载体大鼠牙囊细胞，且大鼠牙囊细胞端粒酶活性增强。3．永生化后大鼠牙囊细胞ALP、OC、BMP2、runx2成骨指标与对照组无统计学差异。结论：1．利

7、用293细胞包装病毒，构建SV40T-Ag逆转录病毒载体对大鼠牙囊细胞的转染是成功的。2．永生化对大鼠牙囊细胞成骨分化基本无影响。关键词：永生化，大鼠牙囊细胞，成骨分化，碱性磷酸酶，骨钙素THEPRIMARYRESEACHONOSTEOGENICDIFFERENTIONOFIMMORTALRATDENTALFOLLICLECELLSLINESABSTRACTPeriodontaldiseaseiswhathappensinthegum，pe哟domalmembrane，alveolarbone，cementumandperiodontaltissue

8、，chroI血nonspecific，infectiousdiseases．Accordingtodifferentdegrees，theclinicalmanifestationsandtreatmenteachdifferent．№iIlclinical‰reareguminflalmnation，hemorrhage，periodontalbagfonning，alveolarboneabsorptionandevenlooseteethfanom．ForseVereperiodontaldisease，wereconstructthealve

9、olarbone，c锄en_tum趾dperiodontalmembranefiberusuallythro