转前强啡肽基因修饰人骨髓间充质干细胞株的建立及镇痛效应研究

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1、硕硕士士学学位位论论文文转前强啡肽基因修饰人骨髓间充质干题目细胞株的建立及镇痛效应研究StudiesontheConstructionandAnalgesiceffectof英文题目HumanBoneMarrowMesenchymalStemCellLineGeneticallyModifiedbyProdynorphinGene姓名杨慧菊学号200571033所在学院汕头大学医学院导师姓名赵国栋专业麻醉学入学日期2010年9月答辩日期2012年5月学位论文原创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包

2、含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文使用授权声明本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。本论文属于：保密（），在年解密后适用本授权声明。不保密（）。（请在

3、以上括号内打“√”）作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日2010级汕头大学硕士学位论文转前强啡肽基因修饰人骨髓间充质干细胞的建立及镇痛效应研究中文摘要目的和背景各种原因引起的慢性疼痛是临床工作中的棘手问题之一，它不仅影响患者的生活质量，也逐渐成为了一项社会负担，但关于这方面的治疗进展甚为缓慢，目前已有的药物疗效尚不尽人意，这迫切需要我们医学工作者寻求更安全有效的治疗方法。经多年的研究证实，生物镇痛具有广阔的发展前景，但目前目的基因、移植细胞和载体的研究尚在进行中。前期研究已证实内分泌肽家族之一的脑啡肽具有镇痛、免疫调节等作用，但要达到理想的镇痛效果需要较大的

4、剂量。后续有研究表明κ受体激动剂强啡肽（dynorphin，Dyn）作为一种内源性镇痛介质，广泛分布于外周和中枢神经系统，其生物镇痛活性比脑啡肽强700倍，Long等[1]发现大鼠蛛网膜下腔注射Dyn的镇痛剂量仅为2.5～5.0nmol就可以达到满意的镇痛效果，更适用于生物镇痛研究。骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）因为具有低免疫原性、多向分化潜能及定向归巢等生物学特性，成为理想的移植细胞。本实验研究拟以重组腺病毒载体为基础，将前强啡肽基因（prodynorphoin,PDP）导入到人骨髓间充质干细胞（hBM

5、SCs），获得能表达强啡肽基因及分泌强啡肽蛋白的干细胞株（hBMSCs-PDP），并移植入坐骨神经慢性压迫性损伤（chronicconstrictioninjury，CCI）模型的大鼠髓鞘内，利用BMSCs的定向归巢和定向分化的特性，实现靶向性转基因细胞镇痛，评价其镇痛效应，为生物镇痛技术的发展和临床应用奠定基础。1.材料和方法1.1重组腺病毒Ad5F35-PDP前期实验肖建斌等[2]人已成功构建用Ad5F35载体制备携带前强啡肽原基因的重组腺病I2010级汕头大学硕士学位论文毒Ad5F35-PDP并馈赠于本实验研究。该实验运用第5代腺病毒Ad5F35，通过与AdM

6、axTM系统进行同源重组，制备了含前强啡肽（prodynorphin，PDP）基因全序列的Ad5F35-PDP重组腺病毒，并对其进行了滴度测定，为本实验对该重组腺病毒的生物学功能研究及今后的转基因治疗奠定了良好的基础。1.2重组腺病毒Ad5F35-PDP转染人骨髓间充质干细胞hBMSCs本实验以重组腺病毒Ad5F35-PDP为载体，将前强啡肽基因（PDP)导入人骨髓间充质干细胞（hBMSCs），获得具有分泌强啡肽特性的细胞株，同时探讨转基因建立的细胞株hBMSCs-PDP的的增殖情况、细胞活力、传代过程中细胞形态学是否发生改变，以及目的基因强啡肽的表达情况。最后通过

7、体内实验，将转基因细胞株hBMSCs-PDP移植入神经病理性疼痛大鼠髓鞘内，利用hBMSCs在体内定向归巢和定向分化的特点，验证hBMSCs-PDP靶向性转基因细胞的镇痛效果。1.3神经病理性疼痛模型大鼠髓鞘内注射hBMSCs-PDP的镇痛效果取健康雄性SD大鼠40只（实验过程中各种原因淘汰的大鼠均由后续实验补齐），体重150～180g，周龄6～8周，随机分为4组（n=10），A组为正常对照组；B组、C组和D组均行髓鞘内置管，导管固定于大鼠背部皮下，且均在大鼠右腿（术侧）通过坐骨神经慢性压迫性损伤法（CCI）建立神经病理性疼痛模型，于CCI术后3d分组给药。B组