plcε基因通过jakstat3信号通路调节膀胱癌侵袭行为的机制研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文PLCε基因通过JAK/STAT3信号通路调节膀胱癌侵袭行为的机制研究姓名：张彦懿申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：罗春丽201205PLC￡基因通过JAK／STAT3信号通路调节膀胱癌侵袭行为的机制研究摘要第—部分P燧西茛】晦瞻黼黼的表达及临床意义目的探讨PLC￡(phosph01ipaseC印silon)基因在膀胱移行细胞癌(transitionalcellcarcinomaofthebladder，TCCB)中的表达及其与TCCB病理分期分级之间的关系。方法采用RT-PCR法检测TCCB组织及相应癌旁组织中PLCe的表达，并分析PL

2、CamRNA表达是否与肿瘤分期分级存在关系。结果TCCB中PLCamRNA表达水平明显高于相应癌旁组织(P0．05)。结论PLCamRNA在TCCB中表达明显增高，且与临床分期相关，推测PLCg在TCCB的发生发展中有重要作用，可作为诊断TCCB的新指标。关键词：PLCe，TCCB，RT．PCR第二部分腺病毒介导的P如s枞犍异性表达裁体的构建及基因沉默作甩验证目的构建腺病毒介导的PLC8特异shRNA表达载体，观察其对膀胱癌细胞株PLCz基因表达的沉默作用，为后续研究PLCg

3、在膀胱癌发生发展中的作用提供实验依据。方法利用PAdeasy腺病毒载体系统，将前期构建的干扰质粒pGenesil—PLC8)及阴性对照质粒pGenesil-NP的表达启动子U6连同shRNA克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFF)报．告基因的穿梭质粒pAdTrack,分别酶切及DNA测序鉴定后，将重组穿梭质粒经pmel线性化后转化入感受态AdEasier。重组pAdeasy-U6．PLC￡质粒经pacI线性化后，经脂质体转染至HEK-293细胞，包装重组腺病毒Ad．U6．PLC8，病毒经在HEK．293中大量扩增后测定滴度，并用PCR、Westernblot及免疫荧光检测受感

4、染膀胱癌细胞株BIU．87、T24细胞内PLCe的表达情况。结果酶切及测序鉴定证实pAdTmck-U6-PLC8及重组pAdeasy-U6-PLC8质粒构建成功，重组腺病毒Ad-U6-PLC8滴度达1．5x1012pfuhrd，受重组腺病毒感染膀胱癌细胞株BIU一87、T24细胞内PLCamRNA及蛋白表达均明显降低(p<0．os)。绪论成功构建针对PLC．芑基因的shRNA重组腺病毒载体Ad．U6．PLC8，为应用基因沉默技术研究PLCe对膀胱癌发生发展的作用奠定了基础。关键词：PLCe，腺病毒，膀胱癌，基因沉默4第三部分PLC￡shRNA对膀脆患细胞麟力黼目的检测Ad-U

5、6．PLCe感染膀胱癌细胞株BIU．87、T24后对细胞侵袭力的影响并探讨相关的分子机制。力瞎PCR和Westernblot法检测膀胱癌细胞株BIU．87、T24细胞感染Ad—U6．PLC￡后MMP．2、MMP．9和VEGFmRNA和蛋白表达的变化。同时用Westemblot检测STAT3活化情况，transwell侵袭试验检测PLCeshRNA对膀胱癌细胞侵袭能力的影响。结果Westemblot和PCR结果显示感染PLCeshRNA腺病毒后，膀胱癌细胞株BIU．87和T24的MMP．2、MMP．9和VEGFmRNA和蛋白表达均减弱，STAT3活化状态受抑制，transwel

6、l侵袭实验结果显示PLCeshRNA感染组膀胱癌细胞的侵袭力明显低于阴性对照组和未感染组。结论PLCeshRNA可能通过下调MMP．2、MMP．9和VEGF的基因和蛋白水平来抑制膀胱癌细胞的侵袭能力，可能是通过JAK／STAT3信号通路来实现的。关键词：PLCe，侵袭，膀胱癌第四部分JAK／STAT3信号通路特异性抑制剂AG490对膀耽当细胞侵袭能力撇目的探讨JAK／STAT3信号通路特异性抑制剂AG490对MMP．2、MMP．9、VEGF和P．STAT3蛋白表达以及膀胱癌细胞侵袭能力的抑制5作用，以验证PLCe是否是通过JAK／STAT3通路来抑制膀胱癌细胞侵袭能力。力嵇分

7、别用高、中、低三种药物浓度的AG490处理BIU．87、T24细胞株，transwell侵袭试验检测AG490对细胞侵袭能力的影响，采用Westernblot法分别检测AG490处理前后STAT3总蛋白、磷酸化形式蛋白和MMP．2、MMP．9和VEGF蛋白表达变化。结果AG490对膀胱癌细胞侵袭力具有抑制作用，且抑制作用呈浓度依赖性，AG490同样抑制P-STAT3、MMP．2、MMP．9和VEGF蛋白的表达(P<0．05)。结论AG490可能通过抑制JAK／STAT3信号通路的激活，从而抑制下游MMP