小鼠神经元轴突生长锥cdk5相关磷酸化蛋白质组学分析

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1、ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentofTheRequirementsfortheDegreeofMasterofphilosophyCDK5-relatedPhosphoproteomicAnalysisofMiceNeuronalAxonGrowthConeCandidate:GaoCaiyunMajor:NeurobiologySupervisor:Prof.TianBoHuazhongUniversityofScienceandTechnologyWuha

2、n,Hubei430074,P.R.ChinaOctober,2012独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交

3、论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在_____年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日目录摘要……………………………………………………………1Abstract…………………………………………………………4正文前言……………………………………………………………7材料和方法第一部分……

4、…………………………………………………9第二部分………………………………………………………13第三部分………………………………………………………15结果……………………………………………………………21讨论……………………………………………………………32参考文献………………………………………………………36创新点…………………………………………………………38综述……………………………………………………………39致谢……………………………………………………………57华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 

5、文小鼠神经元轴突生长锥CDK5相关磷酸化蛋白质组学分析摘要背景和目的神经元的轴突导向作用是神经元与靶细胞建立相互联系的基础，而神经元的轴突生长锥是轴突发挥导向和生长的关键部位。生长锥对轴突的生长和路径寻找是至关重要的。CDK5是一种脯氨酸介导的丝/苏氨酸激酶，它不仅是神经系统发育的关键分子，也是轴突生长和导向的重要调节因子。研究证实，CDK5可对不同的信号传导通路上靶蛋白的磷酸化参与脑发育早期神经细胞轴突分化、生长及导向等神经系统发育事件的调节，并在神经系统退行性疾病、DNA损伤、神经系统肿瘤等病变中起重要作用

6、。目前它已被证实可以通过磷酸化多种轴突生长锥蛋白来调节轴突的功能。在神经系统发生病变的情况下，神经元轴突的退变和萎缩往往是最早期变化之一，但其机理尚不清楚。因此深入研究轴突生长锥的磷酸化蛋白质组学，运用生物信息学软件预测CDK5激酶的磷酸化位点并绘制CDK5在轴突生长锥的底物图谱，可为系统揭示核心激酶CDK5在神经元轴突调节中的分子作用机制提供依据，为全面理解CDK5对神经元轴突调节机制奠定基础，为解决神经损伤和神经系统退行性疾病提供新的靶点和思路，为开发和设计有利于神经再生的药物提供新思路。方法[1]本实验中

7、参考KarlH.Pfenningers等发表的关于神经元轴突生长锥的提取方法，取胚胎16-18天的小鼠，分离出大脑皮层组织，将大脑皮层组织用0.32M蔗糖的匀浆液匀浆后，首先进行1600×g低速离心15min，取上清，然后分别采用0.83M、1.0M和1华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文2.66M的梯度蔗糖缓冲液进行梯度密度超速离心。离心结束后各管均可见明显分层，而轴突生长锥锥蛋白位于0.32M与0.83M之间。将该层组织小心取出后，对蛋白进行提取、定量和消化并采用TiO2法富集含有磷酸化肽段，通过

8、ESI-QUAD-TOF质谱技术进行磷酸化肽段的检测。采用“激酶-底物”预测软件GPS2.1和Scansite3来预测CDK5可能的磷酸化位点，并且与质谱检测到的位点进行比对，综合两种软件最后的预测结果，筛选出与两种软件都相符合的位点。并对相对应的蛋白进行分类筛选，选出与轴突生长和导向相关的蛋白进行体外验证。选取该位点前后5个氨基酸组成的含有11个氨基酸的肽段，体外合成含有双酶切位点粘