神经酰胺对神经元和成肌细胞膜钠通道的调控及其机制的研究

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1、复旦大学博士学位论文神经酰胺对神经元和成肌细胞膜钠通道的调控及其机制的研究姓名：刘征申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：梅岩艾20090415摘要神经鞘磷脂是真核动物细胞膜的主要组成成分之一，也是细胞表面特殊的结构域一脂筏一的主要组成成分。神经酰胺(ceramide)是神经鞘磷脂的代谢产物，它是一种具有多种生物功能的脂质第二信使分子，可以改变细胞膜的脂质环境，也可以通过调节细胞内信号通路影响细胞凋亡或者细胞周期。此外，在多种细胞模型中，神经酰胺类似物都可以直接调控K+和Ca：+离子通道，但它对细胞膜钠通

2、道的调控报导很少。我们采用了两种细胞模型，大鼠小脑颗粒神经元(cerebellargranuleneuron)和大鼠成肌细胞(Myoblast)，运用全细胞电流记录方法研究了体外培养的这两种细胞模型中，神经酰胺的一种类似物，C6．ceramide，对电压依赖性内向Na+离子电流(氐。)的调控作用以及机制。实验结果显示，小脑颗粒神经元上，Na+通道蛋白的主要亚型是NaYl．2，它定位在细胞膜内陷型脂筏(ceveolae)中。在1—100pM的浓度范围内，C6一ceramide可逆性的抑制／s。，但是抑制程度并不和

3、浓度成正比关系。同时，C6一ceramide并不影响氐。的稳态激活和稳态失活特性。C6．ceramide的类似物，C2．ceramide对氐。幅度也产生类似的抑制效果。然而，非活性的神经酰胺类似物，dihydro．C6．ceramide，则对氐。没有调节作用。C6一ceramide对氐。的这些作用都可以被细胞内钙释放激动剂咖啡因(Caffeine)所模拟，而细胞内灌注Ca2+拮抗剂BAPTA则可以消除神经酰胺的作用。如果在大鼠小脑颗粒神经元细胞中灌注软诺丁(Ryanodine)敏感的Ca2+受体拮抗剂钉红(ru

4、theniumred)就可以观察到，N。幅度逐渐增大，并且可以阻断C6．ceramide对，N。的作用，l，4，5一三磷酸肌醇(IP3)受体的拮抗剂xestosponginC或者肝素(heparin)则不能影响Na+电流。如果在大鼠成肌细胞内灌注1，4，5．三磷酸肌醇(IP3)受体的拮抗剂xestosponginC或者肝素来抑制细胞内质网／肌浆网的Ca2+释放，也可以观察到爪。逐渐增大，同时神经酰胺对，N。的作用被消除，注入软诺丁受体的拮抗剂则没有这种效果。钙成像实验进一步显示，C6．ceramide可以明显提

5、高细胞内Ca2+离子浓度。在两种细胞模型中细胞内灌注G蛋白激动剂GTPyS，会导致爪。幅度的逐渐减小，并且显著改变Na+电流的激活、失活特性。G蛋白抑制剂GDPIBS则可以I消除C6一ceramide对瓜a的作用，说明C6．ceramide对氐a的抑制作用很可能是通过G蛋白和磷脂酶C(phospholipaseC)途径，激活细胞内Ca2+释放而实现的。在小脑颗粒神经元中，主要是通过软诺丁受体引起胞内Ca2+通道的开放，而成肌细胞中则主要通过IP3受体介导的Ca2+释放而实现对氐。的调节。这一现象与细胞膜表面的C

6、a2+离子通道无关。而神经酰胺引起的颗粒神经元凋亡现象也不是通过对Na+电流的影响实现的。我们的实验结果初步揭示了生物活性脂类物质可以通过一系列细胞内信号机制影响Na+电流，但它们之间还有很多问题需要在后续研究中继续探索。2AbstractSphingolipidisoneofthemajorcomponentsofeukaryotemembrane，andalsoamajoringredientoflipidraft．Ceramideisamulti-fuctionalsecondmessagerasamot

7、abolinofsphingolipid，itcanalterthelipidenvironmentsofcellmembrane．Ceramidecallinducecellapoptosisoraffectcellcyclethroughmodulatingtheintracellularsignalpathway．Besides．ceramideanditsanalogsmodulateK十andCa2+channelsdirectlyinmanycelltypes．W11ileit’Smodulatio

8、nonNa十channelsisseldomreported．Ourresearchusetwocelltypes，theratcerebellargranuleneuronandmyoblast．Withthemethodofwhole—cellpatchclamprecording，westudythemodulationmechanismofC6一ceramideonvoltag