果蝇中枢神经元钾通道的发育和调控

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1、中国科学技术大学博士学位论文果蝇中枢神经元钾通道的发育和调控姓名：徐太湘申请学位级别：博士专业：生物物理学指导教师：徐天乐20050501摘要黑腹果蝇(D加s叩^妇mPZ册Dg哪据，)因为其分子和遗传背景的广泛研究，是从分子水平研究发育过程和生物功能的非常好的模式生物。而果蝇突变体则为研究离子通道的特异性调节提供了理想的工具。另外，果蝇为变态昆虫，当三龄幼虫离开食物并停止进食后，变态过程即开始。在大部分中枢神经系统，神经细胞的增殖在幼虫后期即停止，随后的变态过程有助于具有成熟特性的神经细胞的进一步发育成熟。而具有成熟特性的神经细胞在此阶段面临着整个神经组织和单个细胞水平的变态

2、重构。变态过程中的单个细胞经历着幼虫时期突起的修剪和长出成熟的突起两个过程。神经细胞的生长和分化的关键因素是兴奋特性的获得，细胞膜上表达的离子通道控制着细胞的兴奋特性。果蝇神经细胞和肌细胞的外向电压门控钾电流大体分为两个成分：快速激活和失活的IA，以及慢速激活和失活的延迟整流成分IK。至少4个基因编码果蝇的电压门控钾通道，鼢日撕口曲Ⅱ妇r编码IA，跏曲和舶洲，编码IK。IA和IK的编码基因在神经细胞和肌细胞明显不同。钙激活钾通道也包括两个成分：快动力学的IcF和慢动力学的Ics。s，oⅥ伊。船编码钙激活钾通道的旺亚基，介导IcF。果蝇的神经细胞和肌细胞电特性的发育在胚胎期和蛹

3、期已见报导，而从三龄幼虫到成虫的变态过程中的神经细胞的离子通道的发育，以及在这一阶段，相关通道突变体对电流发育的影响尚未知。我们采用新建的急性分离的方法获得大量的神经细胞，并系统比较了幼虫、蛹、成虫阶段钾电流和钙电流特性。我们的结果表明在蛹期，离子通道发生了关键性重构，与神经系统的变态过程相巧合。通过对突变体的分析，我们了解了钾通道发育的分子机制，并发现二价离子对果蝇钾通道的选择性调节可能是结合通道表面的特异性位点。1．二价阳离子对野生型和突变体果蝇急性分离的中枢神经元A型钾通道的调节果蝇突变体是在体研究特异性离子通道调控的理想模型。本实验中，我们用急性分离的果蝇的三龄幼虫神

4、经元，并采用全细胞膜片钳记录模式观察二价阳离子对电压门控钾电流的影响。结果显示200州cd2+增加快失活钾电流lA的幅度，而不影响延迟整流钾电流IK。在无钙溶液和咖。突变体(其消除了快失活的钙激活钾电流)中，也观察到类似结果。200pMcd2+和zn2+以及毫摩尔ca2+和Mf+都使IA的稳态失活曲线去极化，却不影响In的电压依赖性激活。而毫摩尔cd2+对IA的激活和稳态失活曲线都产生显著影响。各种二价离子对I。的影响效能不同，表现为zn2+>cd2+>ca2+>M矿+。在舶吖(为～编码IA基因的无效突变)神经元上记录发现，二价离子对IA的影响减弱。以上结果，如通道特异性调控

5、、激活曲线和失活曲线的非对称性影响，以及各种二价离子的不等效能均支持假设模型：二价离子通过结合A型钾通道的胞外特异位点而调节钟电流。2．突变对后胚胎发育期钾通道的影响：急性分离的果蝇中枢神经元的生物物理特性研究果蝇的钙激活钾电流包括两个成分：表现为快动力学的IcF和表现为慢动力学的lcs，这两种成分对动作电位的复极过程超重要作用。我们在急性分离的幼虫、蛹和成虫的神经元观察到sf0Ⅵ伊。妇(ICF的编码基因)的无效突变显著减弱了IcF和Ics，这与以前的研究结果不同。为了更好地研究果蝇神经元电流的发育性调节，我们首次在不同的发育阶段分离并研究了四种外向钾电流成分，包括两种电压门

6、控钾电流IA和IK，两种钙激活钾电流IcF和Ics，另外还记录到内向钙电流。IA在三龄幼虫神经元高表达，而到了早蛹阶段表现为其密度急剧下降，晚蛹阶段逐渐增加，成虫阶段达峰值。肋d妇，(为一编码IA基因)的无效突变黝”的幼虫和成虫神经元IA的密度与野生型相比显著减少。另外，跏”的IA在动力学上表现为缓慢激活和失活，稳态失活曲线超极化。比较而言，IK在中蛹期发育成熟。钙激活钾电流IcF和Ics的密度在蛹期达峰值，成虫阶段则下降。所以IcF和Ics的发育过程与IA发育过程相反。另外，钙电流的密度在蛹期急剧增加，在成虫阶段则下调，与IcF和Ics的发育过程相类似。以上各电流的发育过程

7、也表现在绿色荧光蛋白特异标记的蘑菇体神经元上。这些结果表明离子通道的关键性重组期在蛹期，而蛹期是果蝇整个神经系统和单个神经元的变态重组阶段，提示离子通道的不同发育模式在这个过程中可能起重要作用。关键词：果蝇；发育；胚胎后期；幼虫；蛹；成虫；钾电流；钙电流：鼬口妇r；sZDw妒妇；突变体；神经元；蘑菇体；A型钾通道：cd2+；zn2+；ca2+；M92+；全细胞膜片钳记录lIAbstractDms印向f肠mP肠肋g黜把rhasbeenafavoredo毽aIlismformolecularstudieso