受体及药物引起mkcnq钾通道、钙激活氯通道及内向整流钾通道调控作用及其生理学意义

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1、中文摘要受体及药物引起的M／KCNQ钾通道、钙激活氯通道及内向整流钾通道的调控作用及其生理学意义摘要M型钾离子通道介导一种具有电压及时间依赖性、慢激活、慢去活、非失活的外向钾电流。由于最初发现其能被毒蕈碱Ml受体激活后所强烈抑制，故因此得名。目前认为M通道的分子基础是由KCNQ家族成员(KCNQl．5，又称Kv7．1．7．5)的单或异二聚体所构成。M通道的激活阂值位于．60mV左右，这一特征使得M通道能够在细胞静息膜电位水平附近开放j目前人们认为神经元中M电流可以发挥一种类似“细胞内在电压钳’’的功能，即能对其静息膜电位、动作电位发放阈值等影响神经元兴奋性的因素进行调节，抑制神经元的

2、过度兴奋。M通道在神经系统中有非常广泛的分布，其中在海马、皮层、外周感觉神经元以及一些交感神经元中均有明显表达。此外越来越多的实验证据表明，功能性的M通道在外周负责感觉传递的神经纤维中有表达，并且对神经纤维的兴奋性有重要调节作用。钙激活氯通道(CACC)是一类在包括神经元、平滑肌细胞及上皮细胞等诸多类型细胞有表达，并具有重要生理功能的离子通道口在神经系统中，嗅觉神经元、视锥与视杆细胞、味觉细胞及背根神经元中都存在功能性的CACC。CACC在神经细胞中的主要生理功能是促使神经元去极化，并对由其他离子通道引发的去极化起到加强作用，参与兴奋性的产生。直到最近才由三个实验室共同发现构成CAC

3、C的分子基础为跨膜蛋白16A(TMEM16A)，而这一发现使得人为通过基因手段调控CACC的功能与表达成为可能。内向整流钾离子通道(Kir)包括至少7个亚家族(Kirl．7)，这些通道在组织中分布广泛，能够保持细胞内外K+平衡、维持细胞膜电位，因此在动作电位复极化过程以及调节细胞兴奋性等方面发挥重要作用。近年来有文献报道，Kir2．0家族成员因其与细胞膜PIP2结合力强弱不同，因此在对一些通道调节剂的调节作用方面表现有所区别。本研究论文以上述几种通道为出发点，利用电生理膜片钳、细胞内钙成像、小RNA干扰、原代神经元转染、双电极电压钳、激光扫描共聚焦中文摘要显微镜以及动物行为学实验等技

4、术手段，系统研究了以下几方面内容：(1)炎症介导因子缓激肽引发急性痛觉信号的离子机制；(2)炎症介导因子组胺引发KCNQ／M通道调节作用及其内在机制：(3)第一代抗组胺药物相比其他抗组胺药物在中毒剂量下更易引发严重神经系统不良反应的分子机制。论文具体内容如下：第一部分缓激肽引发急性痛觉信号的离子机制目的：研究缓激肽引发急性痛觉信号的离子机制，观察缓激肽对大鼠背根神经元中离子通道的调节作用。我们发现缓激肽能够抑制M型钾电流的同时激活一种内向离子电流口我们进行了一系列药理学实验和小RNA干扰实验来阐明缓激肽调节M电流的信号通路和这一内向电流的确切分子基础。通过电流钳实验我们又研究了这两种

5、机制是否参与了缓激肽所引发的神经元兴奋性增高。最后通过动物行为学实验，我们在整体动物水平上研究了这两种机制在缓激肽引发动物急性疼痛行为中所发挥的作用。方法：使用打孔全细胞膜片钳观察缓激肽对背根神经元离子电流的影响。使用细胞内钙成像测定细胞内钙离子浓度变化。利用激光扫描共聚焦显微镜动态观察PIP2特异性荧光探针YFP-tubby的变化过程。使用小RNA干扰技术结合神经元细胞核转染的方法探讨缓激肽引发内向电流的分子基础。利用电流钳观察缓激肽引发的神经元兴奋性，并最后通过整体动物行为学测试法，研究相应通道调节剂对缓激肽引发的急性疼痛的作用。结果：(1)缓激肽抑制小背根神经元中的M电流：缓激

6、肽能够剂量依赖性地抑制小背根神经元中的M电流，其抑制作用的EC50为60．04-16．3nM口此外对背根神经元进行纯化培养后并不影响缓激肽的抑制作用。(2)缓激肽引发M电流抑制作用的信号途径：缓激肽能够在背根神经元引发PLC5．PH-GFP出现荧光转位，而对P口2特异性荧光探针YFP-tubby却无作用，说明缓激肽能够激活PLC，但细胞膜PiP2水平却没有明显变化。Ca¨成像实验显示缓激肽能够引发背根神经元细胞内Ca2+浓度明显增高。膜片钳实验进一步证实，缓激肽对M电流的抑制作用受到B2受体拮抗剂Hoe．140，1t'3受体拮抗剂Xe-C，SERCA抑制剂协apsiga玛h圾高浓度B

7、APTA电极内液的显著影响，但并不受PLA2阻断剂quinacrine和PKC抑制剂bisindolylmaleimide影响。(3)缓激肽激活TMEMl6A依赖性的CACC"我中文摘要们发现在缓激肽抑制M电流的同时会引发一种明显内向电流。这一内向电流对TRP通道阻断剂钌红及HCN特异性阻断剂ZD7288均不敏感。但当把电极内液换成低Cl’内液后，这一内向电流消失；而且Cl。通道阻断剂DIDS同样能够明显抑制这一电流的出现。提示这一内向电流是由Cl’通道开