大豆疫霉拮抗菌株的筛选、鉴定及拮抗作用

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安徽农业大学硕士学位论文大豆疫霉拮抗菌株的筛选、鉴定及拮抗作用姓名：杨光红申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：高智谋201206 摘要大豆疫霉砌y幻砌砌DmsD廊P是农业生产上极为重要的植物病原菌之一，由其引起的大豆疫病是大豆生产上的毁灭性病害之一。筛选具有生防潜力的大豆疫霉拮抗菌，可以为寻找病害措施和设计新的疫病控制策略提供基础。本学位论文在大豆疫霉拮抗微生物筛选的基础上，对2株拮抗效果较好的细菌菌株BY．2、BZ．2进行了鉴定，并对其离体及活体拮抗作用以及促生长作用进行了研究，主要研究结果如下：1、采用平板对峙法和杯碟法分别对本实验室保存的哈茨木霉(删砌D如删口^口rzfaM聊)TH．1菌株及枯草芽孢杆菌(曰以cf刀螂s“6疗凰)BS菌株以及6株粉红单端孢(研c矗D砌gcf“m，DJP“m)菌株进行了平板抑菌作用及代谢产物活性测定，结果表明，它们对大豆疫霉的拮抗效果均不显著。2、从安徽省大豆疫病田采集的大豆根际土壤中分离得到4株大豆疫霉拮抗细菌，平板对峙试验显示，其中拮抗细菌菌株BY-2和BZ．2在第5d时对大豆疫霉的平板抑制效果分别为79．O％和63．97％。对菌株BY_2、BZ一2进行了鉴定。经形态观察、生理生化特性测定、扫描电镜观察及16SrDNA、gyrB序列分析，鉴定上述两菌株均为枯草芽孢杆菌(曰口cf，胁s甜6疗凰)。3、测定了不同时间的BY-2代谢液对大豆疫霉的抑制活性，结果显示，72h代谢液对供试病原菌的菌丝生长抑制效果最好；BY-272h代谢液对供试病原菌AHl9的抑制效果显著高于其他各菌株，抑制效果达到40．93％。BY_2菌株72h代谢滤液能显著抑制游动孢子萌发，培养滤液处理24h后孢子萌发抑制率为57．71％，且24h后孢子萌发抑制率显著高于其他各处理。4、采用培养皿对扣法，测定了BY_2菌株挥发物对大豆疫霉的抑制活性。结果表明，BY-2挥发物处理对供试大豆疫霉菌株的菌丝生长均有显著的抑制作用，但抑制率随菌株和处理时间不同而有显著差异，其中对菌株AHl9处理第7d时的抑制率最高，为91．94％。5、对筛选获得的生防菌株进行了盆栽试验测定，结果显示菌株BY-2提前3d浸根接种对大豆疫病的防效显著高于各处理，接种10d后调查防效为75．01％；BY-2菌液处理同时还可显著地促进大豆幼苗的生长；处理的鲜重干重都显著地高于对照，分别增加了63．16％、43．48％，根长和茎长也都显著高于对照，分别比对照增加56．57％、6．95％。6、研究了温度、pH、接种量和培养时间对菌株BY-2的影响，结果表明，菌株BY-2最适生长温度为30℃，最适pH为7．O，最适接种量为2％，最适培养时间为48h，为下一步生防菌剂的开发提供依据。关键词：大豆疫霉，拮抗菌，筛选，鉴定，拮抗作用 AbstI．act脚印Jll砌D阳sQ廊eisoneoftheVe巧importantplalltpatllogenicorgaIlismsina面culturalproduction．SoybenPh)吨ophmorabliglltcausedbytheoomyceteisadestmctiVediseaseofsoybeallintheworld．Screeningofpotentiala11tagonisticbact谢aagainst脚印矗砌Dms咖口willbehelp向1for6ndingnewtargetsofcheIIlicalcon仃olandproVidinggoodideasfordesigningnewcon勃rolsb．ate百es．BasedonthescreeningmicroorgaIlismsagainst脚印^砌DmsQ尬e，theidentificationofstrainBY一2andBZ一2andtheiraultagonisticactiVitiestoP．sQ尬Pwerecarriedoutinthisp印既Themainresultswereasf’ollows：1．Byusingag扑platedualcultureandtheCupplatemethod，theiIlllibitoryactiVititiesofmesix乃·fc矗D砌ecf甜m，琊e“聊s仃ainsand乃记办D(纪，．m以办口圮胁儿f聊s仃ainTH一1andB以cf，胁s“6疗Z如s昀inBSkeptiIlour1aboratorywereinVestigatedrespectiVdy，aIldmeresultsshowedthatmeinhibito巧e妇暗ctsoftheseisolateswerea11notsi弘ificantagainstPs咖P．2．Fourantagonisticbacterialstrainswereobtainedbycollectingandis01atingf两mtherhizospheresoilofgrowingsoybeaIlinthediseasedfielsofA11huiproVince．Intheplatedual—culnH．etest，the锕obacterialis01ates，BY．2andBZ一2，锄ongth锄showeds仃ongantagonisticactiVitiesagainstPJQ廊已，withtheiIlllibito叫e髓ctsof79．00％and63．97％，when6vedays，respectively．Therefore，theidenti6cationofBY-2andBZ-2wasdone，respectiVely．BaSedonmo坤h010百caltest，themo印h010百calandphysiolo西calandbiochemicalaIlalyses，observationbyelec仃onmicroscopea11dphylogeneticanalysisof16SrDNAa11dgyrBsequences，thetwos缸．ainswerealliden蠲edas曰口cf刀淞J拍打凰．3．Tllei1111ibito巧actiVitiesofdi脓ent—timemetab01ic1igllidofstrainBY-2against尸s咖eweretested．Theresultsshowedmattheinhibito巧efrectof72hmetabolicliguidonmycelialgrowmwasthehi班est，withtheiIlllibito巧e虢ctof40．93％；theiIlllibito巧e位Ctof72hmetab01ic1iquidofBY-2toPs巧口PAH19isolatewassi印ificaIlthi班ermanmatofallothers仃ains．TheresultsalsoshowedtllatBY．272hmetabolicfil仃atecouldsi嘶jficaIltlyinhibitthegerminationofzoosporesand．theinhibito巧e虢ctofBY-2waSupto57．71％at24haRer仃eatingw讹themetabolicfil缸．ate，w“chwassi印ificalltlyhi曲ertllanthatoftheother仃eannents．4．Theinhibito巧actiVityofVolatiles劬mBY-2againstPsQ如wastestedbymeaIlsofdish_buttoningmemod．TheresultsshowedmatmevolatilesofBY．2caIls仃onglyiIlllibitmyceliumgr0叭hoftestedisolatesinPs咖P．However，thei1111ibito巧ratesofvolatilesweresi印mcantlydifrerentwithdi髓rentPs咖PisolatesanddifferentlI treacInenttinle．AndtheiIlllibitionrateagainstAHl9at7d心ertreanIlentwasmehi曲est，reaChing91．94％．5．Thepottedexperimentwasc枷edouttoex锄inethe觑vfvDcontrole仃．ectivenessalldgrowm。promotionofmebiocontrolstrainsobtainedbyscreeningexperiments．Theresultsshowed廿1atthecon协01eH’ectiVenessofstl面nBY二2tothediseasebyappl姐ngmotdippingwithmebact嘶al1iquid3dayspriortoinoculationwassi删6camlyhi曲ert11aIlthatoftheother仃eatIIlents，andthecontr01e能CtivenesswaS75．01％at10daRerinoculation．Atthes锄etime，mebaCteriumnuidofBY二2couldpromote廿lesoybe觚growthsi萨mcaIltly．Compa硼withthecon缸Dl，tlle舶shwei曲tandt11ed巧weightincreasedby63．16％and43．48％，aJldmerootslengmandtllesteInslengmincreasedby56．57％aIld6．95％，respectiVely．6．Theinnuencesoftemperature，pH，inocul眦dosageaIldculturetimeons仃ainBY-2werestudied．TheresultsindicatedmatmetheoptiInumt锄peratIlrewaS30℃，meoptiIIlumpHwaS7．0，theoptim啪inoculumdosagewas2％andthe叩timumcultllretimewaS48hours．Undertheseconditionsthes缸．ainCouldgrowbettera11dgain吐lehigllestanti血ngusactiVity．ThiswouldprovidethebaSis南rmenextdevelopmentofbiocontI．olagents仔oms扛ainBY．2．Keyword：脚卸办髓D朋sQ加岛Jcreeninganta90nisticbact舒a'identi矗cation，antagonisticactivityIII 文献综述1大豆疫病概述1．1大豆疫病发生概况大豆疫病又叫大豆疫霉根腐病，由大豆疫霉(助)，幼咖砌。朋s咖eKau缸锄etGerdeIIlann)侵染引致，为大豆生产上的危险性病害，被公认为是继大豆胞囊线虫病害之后的第二大严重影响大豆生产的病害。虽然它的发现相对较晚，但它传播速度却很快，为害面积大，危害程度也十分严重。此病害为典型的土传和种传病害，一旦传入，可在病区长期存活，难以根治【l巧】。该病自1948年在美国东北部的印第安纳州首次发现以来，迅速在美国流行，不久在俄亥俄洲西北部的一个县发现，继而在美国的北卡罗那，密苏里及伊利诺斯州相继发生并造成大面积危害，1957年该病在俄亥俄洲所有的大豆田发生，每年由该病造成的经济损失约为150万美元。1978年该病在美国第二次爆剔6|。在我国，自1991年沈崇尧等【7】首次在东北地区发现该病后，已经在黑龙江、北京、山东、安徽、河南、江苏、浙江、内蒙古、四川、天津等15个省(市)大豆产区发现该病‘7。10】，大豆疫霉在我国的大豆产区已有较大范围的发生【11】。目前，美洲、欧洲、亚洲以及大洋洲等近20个国家和地区的大豆产区发现有关该病的报道，每年造成的经济损失高达数十亿美元【7‘9】。鉴于大豆疫霉在大豆生产上的严重破坏性和毁灭性，自1986年以来，大豆疫霉一直被我国列为对外检疫性重要病害，1992年被列为“进境植物危险性病虫杂草名录’’中的A1类病害，1995年大豆疫霉又被列为国内植物检疫对象，一直受到检疫部门的密切关注【l21。1．2大豆疫病发生规律大豆疫霉是典型的土壤真菌，以卵孢子在土壤和病残体中越冬并长期生存，其他器官如菌丝、孢子囊、游动孢子等则不能在土壤中长期生存【l31。卵孢子抗逆性强，可以在土壤中存活数年。病原菌通过带菌的种子和混杂在种子中的病残体及病土粒作远距离传播。在大豆的生长季节，当水分、温度等条件适合，卵孢子萌发产生游动孢子囊继而释放游动孢子产生初次侵染。侵染菌丝在大豆的茎基部和根部的表面形成游动孢子囊，进一步产生再侵染。游动孢子在水中的游动距离比较短，对大豆间的再次侵染作用不大，但可以通过水流扩散，扩大病害发生范围【14】。越冬的卵孢子在温度和湿度适宜时，打破休眠、萌发产生孢子囊，雨后或灌溉后有积水时，孢子囊很快释放出大量游动孢子，游动孢子随流水在田间 传播，成为初次侵染源。而游动孢子受寄主根系分泌物的吸引，朝根系游动并在根组织上休止、萌发。游动孢子在根部产生芽管定殖，菌丝在寄主细胞间通过吸器寄生生长，吸取营养引起植物发病。同时病菌还会在受侵染植株的根系表面产生大量孢子囊，并将游动孢子释放到土壤中，随流水传播，成为再次侵染源【151。当浇水或风雨将病土溅到叶面上时，可引起叶片发病，病害加重时病菌可向叶柄及茎部扩展【I6|。有时在逆境条件下，大豆疫霉亦可产生厚垣孢子，从而度过不良环境条件。大豆疫霉幼龄菌丝无隔、多核；老龄菌丝具隔膜。菌丝体较宽，2．6～8．8岬，菌丝膨大体，埋生在培养基内的菌丝体常卷曲。菌丝体近直角分枝，分枝的基部缢缩。孢囊梗单生，无限生长，多不分枝。孢子囊项生，无色，倒梨形或长椭圆形；无乳突，顶部加厚或具半乳突。孢子囊不脱落，内层出。萌发产生游动孢子或芽管。同宗配合产生雄器和藏卵器。雄器不规则形，侧生，有围生。藏卵器壁薄、光滑，球形至亚球形，直径32～41岬。卵孢子球形，直径27～36岬，壁厚，光滑，厚1～8岬。成熟和休眠状态的卵孢子细胞质呈颗粒状，中心有折光体，边缘有一对透明体【l71。大豆根腐病主要发生在幼苗期，成株较抗病，病株根及茎基部形成褐色椭圆形、长条形或不规则形病斑，凹陷，继而成环绕主茎的大斑块，甚至危害侧根，病菌主要侵害皮层，较少进入维管束组织。病株后期根部变黑褐色，表皮腐烂，侧根、须根少或坏死。病株矮黄，下部叶片提早脱落。除少数苗期严重感病枯死外，病株一般不枯死，但是荚少、粒小，影响产量。土壤含水量、感病品种和大豆疫病菌生理小种的变化是大豆疫病发生的关键因子。影响土壤湿度如土壤类型、排水条件、土壤疏密度对病原菌的致病力表达具有重要作用。大豆对大豆疫病菌的抗性为小种专化性抗性，品种间有明显的抗感差异，感病性是导致大豆疫病发生的主要因素之一。温度在22．280C之间最有利于该病的发生与流行，大豆疫病多发生在土壤湿度高、田间低洼或积水处，土壤厚重、压实以及连作或氮肥多的田块。1．3大豆疫霉菌的生物学特性大豆疫病菌(脚幼咖砌DmJQ加P)的最适生长温度为25～280C。在胡萝卜、玉米粉、V8等培养基上生长较快，菌落均匀，边缘整齐，气生菌丝较发达，疏松，呈棉絮状，基生菌丝较少；在利马豆培养基上生长稍慢，气生菌丝不发达，致密，基生菌丝发达，形成卵孢子多而快；在PDA培养基上生长缓慢，菌落均匀，边缘不整齐；菌丝宽3．9cm，卷曲；菌丝珊瑚状且近直角分枝，无隔，分枝处稍缢缩。成熟菌丝可形成膨大体和厚垣孢子【18】。游动孢子倒梨形或椭圆形，无乳突，着生囊柄上，不易脱落，人工脱落时不2 具囊柄。孢子囊含大量游动孢子；孢子囊可直接萌发形成侵染菌丝。游动孢子一端或两端钝圆，侧面平滑，具两根鞭毛；游动孢子的螺旋状运动，可持续几天，具向化性，遇寄主休止萌发。有性生殖为同宗配合。雄器侧生，偶围生。藏卵器球形或亚球形，直径29—58岬，壁薄；藏卵器受精后发育为卵孢子，卵孢子在适宜的条件下萌发产生芽管，芽管形成菌丝或产生游动孢子囊‘19】。2大豆疫病的防治2．1加强植物检疫大豆疫霉在大豆生产上具严重的破坏性和毁灭性，自1986年以来，大豆疫霉一直被我国列为对外检疫性病害，1992年被列为“进境植物危险性病虫杂草名录"中的Al类病害，1995年又被列为国内植物检疫对象。我国部分省已经存在并造成危害，该菌有大量生理小种，仅国外报道就有39个生理小种，且存在大量无法明确归类的中间过渡类型。因此，严格进行检疫是必要的防控手段，可避免新小种的进入，防止病害向非疫区扩张【201，保证不从病原区引种，是防治大豆疫霉最直接有效的措施。2．2培育和利用抗病品种培育和利用抗、耐性品种是防治大豆疫霉最经济有效的防治措施[21。241。抗大豆疫霉品种主要分为两类：一类小种专化抗性，应用最广泛；另一类是小种非专化抗性，目前应用较少。大豆疫霉与大豆之间的相互作用关系符合基因对基因假说，主要表现为大豆疫霉的无毒基因与大豆的抗病基因相对应。利用抗病品种是防治大豆疫病最重要的手段之一。然而病原菌群体是变化的，抗性品种在种植过程中会渐渐被变化的病原菌群体所克服，造成原来的品种抗性丧失【211。我国被认为是大豆的起源地，存在着丰富的抗大豆疫霉资源。近年来，对大豆疫霉的生理小种研究发现我国大豆疫霉绝大多数都带有无毒基因彳V，Jc和彳v，．J砖22'231，因此可利用带抗大豆疫霉J『c和J七基因的大豆品种来防控该病。目前，已经鉴定了13个抗大豆疫霉菌的显性单基因【24】。但单基因抗性强，对病菌选择压力大，易促进新的生理小种出现，使原来的品种丧失抗性，因此应对抗病品种进行合理布局，可在同一地区种植多个抗病基因不同的品种，避免品种单一化，可延长抗病品种的抗性保持年限，也可利用遗传育种的手段，将抗病基因转入耐病品种中，利用小种非专化抗性对防治大豆疫霉的持久性更好。2．3化学防治大豆疫霉为典型的土传病害，在大豆的整个生育期造成严重损失。目前，用于防治大豆疫霉的高效、低毒的杀菌剂主要有甲霜灵、甲霜灵锰锌等，这些药剂3 在实验室生物测定中对大豆疫霉菌具有很好地抑制作用，其中甲霜灵的抑菌效果最突出【2引。由于甲霜灵在内吸性、生物活性和持效期方面均优于同类化合物，因此在同类杀菌剂中，该药剂在生产上使用最广泛。由于甲霜灵对病菌的作用位点单一，病原菌易对其产生抗性突变【26l，因此，开发新型杀菌剂的要求尤显重要。李宝英掣27】报道，用种子重o．2％的瑞毒霉拌种进行盆栽试验，对大豆疫霉的防效较好，防治效果达75％～80％。吴炳芝等【28】研究表明：用58％的瑞毒霉锰锌可湿性粉剂按种子量O．3％拌种，防治大豆疫霉的大田防效达91．8％，增产14．8％；其次是72％克露可湿性粉剂，大田防效达85．3％，增产12．4％。此外，烯酰吗啉、氟吗啉、氟吗啉·锰锌等，在离体条件下对大豆疫霉具很好地抑菌作用，其中以烯酰吗啉效果最好。在活体条件下，这些药剂能较好的抑制大豆疫霉对感病大豆品种的侵入，且持效期较长。大豆疫病为土传病害，在大豆的整个生育期均可为害，因此化学药剂防治较困难。2．4农业防治研究结果表明：土壤湿度是大豆疫霉重要的影响因素‘29，301，土壤水分是影响大豆疫病发生的关键因素。大豆疫霉菌卵孢子的萌发、游动孢子的释放及侵染寄主需有高湿的土壤条件，低洼积水处常是病害发生严重的地块。因此，建立有效的排水系统控制田间积水量可减轻病害的发生，对大豆田进行科学的的水肥管理，可减轻病害的发生。此外，垄作、与非寄主植物轮作，对减轻病害发生也有一定作用。2．5生物防治以生物防治手段来控制农作物病害，早在上世纪20年代就已经开始。1921年H积Ley报道，用十几种常见土壤腐生真菌和细菌来防治树苗的腐霉根腐病。1926年Sallf-ord报道，土壤中一些拮抗性微生物对于土传病原菌具抑制性，因为当时美国马铃薯上发生一种放线菌(勋印幻彬yc嚣s∞6f卵)引起的疮痂病。MiLL棚在1921年报道，用绿肥可减轻这种病害，经Sanf．ord分析证明是由于绿肥促使土壤中拮抗性放线菌增长所致，指出其生物学防治的实质。这一发现并未引起普遍关注，不久青霉素的问世，再次掀起寻找拮抗微生物的高潮，尤其是土壤腐生拮抗性放线菌发展较快，从此开始了寻找土壤拮抗微生物作为病害生防因子的研究。尽管人们很早观察到病害的自然防治现象，但有目的地利用有益微生物来防治植物病害历史并不长。植物病害生物防治研究的快速发展是在二次大战以后，人们开始从生态学角度来研究植物病害的发生、发展和防治问题，开发安全有效和对环境无害的微生物生防制剂逐渐成为人们关注的焦点。目前，国内外学者从4 土壤中筛选到许多有益的微生物，为植物病害的生物防治提供了可利用资源，有许多生防菌已开发成为生防制剂，广泛用于生产实践中。细菌在植物病害生物防治中是非常重要的，无论是自然发生的生物防治现象还是在人为生物防治研究中。细菌在植病生防中的优越性在于其种类和数量众多，生长繁殖速度快，作用方式广以及利用营养物质强的能力。目前用于病害生防的细菌主要是芽孢杆菌(B口cf，如岱spp．)和荧光假单胞菌(风P“Dd加D，l娜spp．)以及其他属的细菌，如放射性土壤农杆菌(彳g加6口c抛一“聊，口讲D6口c自盯)等，这些细菌多数可产生抗菌物质，对植物病原菌的生长和繁殖具抑制作用。我国是生物防治应用最悠久的国家。公元304年，晋代嵇含的《南方草木状》和公元877年唐代刘恂的《岭表录异》记录利用黄獠蚁(Dec印批L口Jm口川触n口)来防治南方柑橘病虫害。我国植物生防研究工作始于50年代初期，曾选出一批有效菌种用于生产实践，如筛选的拮抗性放线菌用于棉花、蔬菜种子处理以控制种子及土壤传播的病害。60年代开始，利用一些真菌、细菌以及病毒等，从腐生的土壤微生物到植物体微生态系中微生物的利用；病害种类从种传和土传病害到地上部的气传和虫传病害。70年代以来，病害生物防治的研究和实践发展迅速。日本报道用非致病性尖孢镰刀菌(凡岱口一“mo砂驴D一“m)处理甘薯芽苗以防治F傩粥pDrf“m￡sp．6让口勉，引起的萎蔫病。到80年代，陈延熙等研制出植物保健益菌“增产菌”菌剂，提出了“植物体自然生态系”的观点。进入90年代以来，由于“生态农业”、“有机农业”呼声日高，生物防治发展迅速，己成为水稻、小麦、玉米、棉花、果树、蔬菜等作物病害综合防治中的重要技术措施。最近几年，生物工程技术与分子生物学技术相结合为农业可持续发展提供新的途径和新的技术，生物防治迅猛发展。利用遗传工程将苏云金芽孢杆菌的杀虫基因移植到棉花、烟草的原生质体，获得具有抗虫基因的新植株；在番茄上获得了抗病毒基因工程新植株，为我国开展构建抗病虫基因工程植物奠定了良好基础。因此，应用遗传工程、生物技术等高科技手段控制有害生物危害的前景十分广阔。3植物病害拮抗菌的生防机制3．1产生抗生素拮抗作用是一种生物在其生长过程中产生一些代谢产物，该物质对另一种生物具有抑制生长发育的作用，从而使另一生物群体生长发育受到抑制，该物种本身的生长发育不受影响。一些生防菌抑制病害发生的机制就是通过产生的抗生物质来实现的。如枯草芽孢杆菌(B．s“6打凰)可分泌伊枯草菌素(Itunn)【31】，洋葱假单胞杆菌(Pc印口c)能产生毗咯烷酮类抗生素‘3羽，抑制多种致病微生物的 生长，木霉菌产生胶霉素(G1iotoxin)、木霉素(Trichodemin)、绿木霉素(Ⅵridin)p3】等生理活性代谢物来抑制病原菌的生长发育。隋勤等【34】从土壤中分离的链霉菌，命名为A02菌株，发现其发酵液中具有一种与四烯大环内酷类抗生素纳他霉素结构相同的化合物，这种化合物可以拮抗多种病原微生物；刘颖等【”]研究发现，在枯草芽孢杆菌分泌的抑菌活性多肽中，一小分子环肽具有较强的抗真菌活性。细菌离体培养产生的抗真菌代谢物在活的有机体里仍有活性，这些代谢物包括氨、丁酸内酷、2，4．双乙酞间苯三酚、氢氰化物、寡霉素A，藤黄绿脓素(PLt)、毗咯菌素(PLn)、酞胺粘液菌素、黄色细菌素、雌雄霉素A和一些不确定物质p6|。通过产生抗生素在植物病害生物防治中发挥作用的细菌多集中在以下几个属：假单胞菌属、芽孢杆菌属、土壤杆菌属、欧文氏杆菌属、布克氏杆菌属等【37，弼J。假单胞杆菌属在人工培养条件下产抗生素的能力最强，布克氏杆菌和芽孢杆菌也有一定的产抗生素的能力【39，删。抗生素吩嗓一1．酸(PCA)和2，4．二乙酞藤黄酚(2，4一DAPG)是荧光假单胞菌产生的最典型的2种次生代谢产物，可防治由禾顶囊壳菌引起的小麦全蚀病。王金生等【4l】从水稻的菊欧文氏杆菌中分离提取到一种细菌素，研究证明，细菌素是一种细菌产生的对不同细菌系或亲缘种的细菌具拮抗作用的抗菌物质，其成份主要为蛋白质、多肽、核苷酸、生物碱类等。任欣正等【42J从青枯假单胞菌nOE．104提出具有生物活性的细菌素，分子量为19kD，具蛋白质性质，含16种氨基酸。吴蔼民等【431发现内生细菌对棉花黄萎病菌毒素具抑制作用，且对棉花有促生作用。研究报道，细菌素的主要作用是抑菌而不是溶菌或杀菌。生防微生物产生的其他抗菌物质还有嗜铁素、胞外裂解酶等，它们在细菌土传病害的生物防治中都具重要作用。芽孢杆菌能够产生休眠体芽孢，芽孢具很强的抵抗不利环境能力，芽孢杆菌能产生细菌素、抗生素等种类多样的拮抗物质，由于大部分芽孢杆菌能产生一种以上的抗生素，而植物对多种抗生素同时产生抗性的可能性很低，芽孢杆菌在植株根部定殖能力较强，利用芽孢杆菌进行生物防治优于传统用化学农药进行病害防治。如Stabb等哗1从土壤中分离到的曰口c讲淞∞陀淞UW85菌株，发现其高效地抑制m矗f“m脚鲥蚴如引起的苜蓿猝倒病，发现它可以分泌两种抗生素(KaIlos锄ine和ZwittemicinA)，发酵液纯化这两种抗生素，表明它们可以直接抑制病原菌的生长。王慧萍等[45】从茄子根际土壤筛选的环状芽孢杆菌，发现该菌株能分泌几丁质酶和1，3一葡聚糖酶，它们对大丽轮枝菌具明显抑制效果，盆栽试验的防治效果50％以上。MiLner等【461对肋cf，如岱钟馏淞进行诱变，得到一系列抗生素合成量减少的突变体，发现鼢cf刀淞cP陀螂合成抗生素量降低的同时其抑菌活性随之降低。抗生作用的机理，目前的6 研究认为是多种机制，有的是抗生素作用于细胞，引起歧变并出现囊泡肿胀而裂【471，有的是抗生素破坏菌体细胞壁的完整性，造成原生质泄漏，菌丝体断裂而溶【48】。3．2竞争作用竞争作用包括空间、位点、营养等竞争作用。生防菌优先占领一定的生存空间，使病原菌与植株间形成一个隔离带，病原菌不易侵入，生防菌和病原菌都属异养生物，需一定的营养赖以生存，如水分、氧气、养分等，生防菌可通过营养竞争使病原菌丧失生长所需的充足营养而受到限制【491。假单胞菌的强竞争能力是其发挥生物防治作用的关键因素，而微生物在根圈的成功定殖才真正发挥生物防治价值。刘国奇等【50】从韭菜根内分离出荧光假单胞菌P肛“D愆鲫∞凇DEl，通过拌种回接韭菜实验发现DEL定殖于韭菜根表、根内和根围。营养竞争作用是生物防治草坪病害的一种重要机制[5¨，主要是铁离子竞争。铁离子缺乏使一些草坪病原菌丝体生长受抑制【521，很多荧光假单胞菌可产生绿脓菌荧光素等铁载体，这些铁载体可以螯合铁离子将其转入细胞壁内。芽孢杆菌在植物表面或体内定殖与生存后，优先占据各种生存资源，造成没有空余的生态位供病原菌利用。植物内生芽孢杆菌一般都具较强的在植物组织内定殖能力，对维管束病害和各种土传病害具良好的防治效果。P11lsky等【53】发现，枯草芽孢杆菌可除去鳄梨炭疽病菌(CD￡LPc幻纱f幽“m驰Po印D厂fo矗勉)附着胞周围的营养，造成病菌处饥饿休眠不能完成侵染。Bacon等【54】分离发现玉米内生枯草芽孢杆菌与玉米病原真菌串珠镰刀菌(鼢口以“掰mD刀圮帕删P)有相同的空间生态位，其能在玉米体内迅速定殖和繁殖，优先占有玉米内的空间与资源，造成串珠镰刀菌不能定殖或大量繁殖，有效降低了串珠镰刀菌毒素的产生对玉米的危害。王占武等【55J研究枯草芽孢杆菌B501在草燕根际和根表的定殖时发现，该菌促进草燕根围的细菌、放线菌等有益菌的大量增殖，与病原菌争夺营养与水分等资源，降低了病原菌的危害能力，减少病害的发生程度与机会。3．3重寄生作用重寄生作用是植物病原菌被其它生物寄生的现象。在植物病害生物防治中研究和应用最多的是真菌对真菌的寄生和病毒对真菌的寄生。白粉寄生菌是第一个被发现与白粉菌有重寄生关系的真菌，对白粉菌目、毛霉目和暗绒菌目有拮抗作用【56】。它能直接进入几种白粉菌的菌丝体和分生孢子梗内，并在它们的分生孢子梗内形成自己的分生孢子器。当一种微生物以寄生的方式在另一种生物体内存在时，它可通过从寄主体内获得营养物质，从而对寄主种群的增长进行控制。如果被寄生的生物是病原菌，该病原菌的生长环境和营养被破坏，无法形成病害。7 芽孢杆菌能够寄生的真菌很多，常见的病原菌有腐霉(缈砌f“聊)、镰孢属(‰口一“，，1)、长蠕孢属(月吐聊砌砌。印D一“m)等，使它们的侵染能力丧失或种群数量下斛571。wisniewsl(i等‘581研究发现，附于青霉菌或灰霉菌的菌丝上的拮抗酵母，导致青霉菌或灰霉菌菌丝凹陷，吸附于灰霉菌上的吸附位点的细胞壁会部分降解。而无拮抗性的酵母与灰霉菌共培养时没有在菌丝表面出现凹陷。EL—Ghao砒等【59】发现，吸附于灰霉菌菌丝上的国，z历如s口泐聆口Nal(ase＆Suzubi能导致菌丝产生肿大。3．4诱导抗性和交叉保护诱导抗性和交叉保护指对病原菌有关但对寄主无害的微生物感染植物寄主后，诱导或刺激植物体对病原菌系统产生抗性。这种诱导或刺激植物所产生的抗性不同于拮抗现象，拮抗作用是研究微生物之间的作用，而诱导性则是研究寄主与病原物或非病原物之间的关系。它与化学防治和抗病育种相比具有优点是：作用稳定，决定几种不同的机制，而内吸杀菌剂往往具有单一的作用位点，容易产生新的抗药小种，是不稳定的；作用系统、稳定，有的寄主中的免疫作用可通过嫁接从砧木传到接穗；在感病植物中亦具有抗病能力，说明潜在的抗病基因存在与所有的植物中。某些拮抗菌可诱导植物产生抗性，获得抵御病原菌侵入能力。植物产生诱导抗性有两种形式：系统获得性抗性和诱导系统抗性。当病原菌或致病力较弱的菌株侵染植物时，植物体作出相应的反应，产生过敏性或非过敏性免疫反应，并产生植物保卫激素，称之为系统获得性抗性。诱导抗性是通过非病原物诱导植物体产生抗病应答，可以是生物因子，也可是非生物因子，作用于植物后，激活了该植物的免疫系统，从而产生系统抗性，这种抗性的获得不是病原物的侵染引起，这是于系统获得性抗性最大的不同点。研究表明，某些芽孢杆菌能诱导寄主植物产生抗病性，对病原菌的抗性机制有物理结构上的改变和生理生化方面的变化。物理结构上的改变有细胞形成结构致密的保护层，寄主细胞壁增厚形成乳突，细胞机械强度增强等，阻碍了病原菌的侵入或扩展【缸67】；生理生化活性方面的变化主要是病程相关蛋白的积累[63】，产生水解酶和氧化酶【鲫，合成植保素及其它代谢产物等[65】。EL．Ghaoutll等p蜘研究发现，p熠幻∞cc螂s口f幻，z以可诱导寄主在细胞壁上形成乳突毛这样的结构性障碍，还可以诱使植物体产生几丁质酶，这些都在一定程度上抑制病原菌心刀fc也￡f“m￡印口珊“m的侵染。Wisniewskj等【53】发现，一些拮抗菌在与寄主细胞壁接触处会产生大量的液体，推测这些液体物质可能与细胞附着、信号识别及级联信号反应有联系，推动植物做出相应的防御反应。这个推测在Bause等【6副的报道中得到证实，研究酵母细胞壁上的低聚糖片段时发现，这些 低聚糖片段充当了活性诱导子的角色，激发了宿主细胞产生防御反应。目前，国内外开始研究生防菌的遗传背景，克隆和分离了一些抗菌物质的基因。要使拮抗细菌达到理想的效果，将生物工程技术与生物防治技术相结合，即遗传工程拮抗细菌和抗菌物质的改造以及把拮抗细菌的抑菌基因转入植株基因组中获得高抗或免疫品种三者结合起来，提高拮抗细菌的生防水平，将是拮抗细菌的研究目标。3．5溶菌作用植物病原真菌细胞壁成分复杂，主要是由几丁质、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖等多糖物质。很多生防菌能够分泌几丁质酶、葡聚糖酶等水解酶产生溶胞作用，能够溶解真菌细胞壁成分如几丁质、葡聚糖，抑制病原真菌的生长【69。7¨。许多生防菌在与病原菌相互作用时产生这两种酶。如根际粘质沙雷铁氏菌(．％删砌，，z口坩缈cg珊)分泌几丁质酶，有效防治菌核病(&比D硝“m椰ff)。生防菌(彳PDmD，z甜∞’，缸P)通过对土壤中病原真菌立枯丝核菌(尺砘刀c铆D砌J以绷f)和小菌核菌(s吐e，D巧“聊加Dd)的寄生，抑制病原菌菌丝体生长【‘72，73】。有证据证明，在用链霉菌属促生菌防治土传病害中，链霉菌产生的葡聚糖酶具重要作用【74J。4拮抗细菌生防研究的展望理想的拮抗细菌应应具下列条件：繁殖快、生活力强、性状稳定、不易突变、对不良环境有良好的适应性、具有选择拮抗作用、对病原菌应具广泛的拮抗作用、对土壤中其它拮抗生物没有伤害、对寄主植物无害、适宜于大面积推广使用和商品化生产、适于与化学农药混合使用。为提高原始生防菌株的拮抗能力，可进行菌种选育，改良获得的工程菌较传统的生防菌优势明显，杀菌谱更宽、毒力提高、田间药效长、虫病兼治、生物防治效率高等。这种改良后的产品较传统的生物杀菌剂将具更高的生防效率和更强的市场竞争力。目前的菌株改良手段主要是诱变育种，原生质体融合以及遗传改造。微生物诱变育种具有方法简单、育种速度快、可以在短期内使微生物某些特性得到大幅度的改良，不断满足生产发展所提出的新要求，是目前被广泛使用的微生物育种主要方法之一。尽管一些优良菌种的选育主要是采用诱变育种的方法，但是某一菌株长期使用诱变剂处理后，其生活能力一般逐渐下降，诱变因素对产量基因影响的有效性降低等；原生质体融合技术可以在种间、属间及科之间构建出新型菌株，也是菌种改良的重要手段之一，但原生质体融合过程中由于融合子遗传性获得的随机性和不稳定性，影响育种的可靠性；基因工程技术比其他育种方法更有目的性和方向性，可以按照人们事先设计和控制的方法进行育种，是当前最先进的育种技术。通过基因工程手段对拮抗细菌进行改造、把拮抗细菌9 的抑菌基因转入植株基因组中获得高抗或免疫品种和对拮抗细菌产生的抗菌物质进行改良，三者结合起来，提高拮抗细菌的生防水平，将是拮抗细菌的研究目标。生防细菌从实验室走向田间是一个复杂的过程。阻碍许多生防菌田间应用的重要问题是菌剂的货架储藏期短，可以将它制成干粉剂型，以延长菌剂的储藏期，而由曰以cf批制成的菌剂，因为它能够产生耐热抗逆的芽孢，便于菌剂的研制和剂型的加工，这也是市场上由肋cf刀搬开发的菌剂较多的一个主要原因；为避免植物病原菌对生防细菌的拮抗物质产生抗性，最好采用混合菌株研制生防菌剂；通过提取和纯化其抗菌物质，才能将微生物发酵品变成真正的、标准的生物农药，保证防治效果的稳定性，从而更好地用于农业生产。5生防制剂商业化进程中存在的问题和对策生物制剂指利用生物活体及其各种生物活性成分制备的用于防治植物病虫害、杂草、鼠害以及调节植物生长的制剂的总称。全世界有80多种生物产品已实现商品化生产【75|。现有商品化生物制剂大部分用于控制温室的土传病害。如小盾壳霉、绿粘帚霉、哈茨木霉、灰绿链霖菌及链袍粘帚菌等真菌和许多拮抗性细菌制剂【‘76。。78】。生物防治菌作为一种生物菌剂，对环境安全、无污染、无抗性，保证人畜安全，避免采用化学防治方法所带来的许多弊端，应用前景广阔，在科研与生产上引起广泛关注，也取得令人瞩目的成就。但是在利用生物菌剂防治病害的过程目前还存在着许多问题和挑战。到目前为止，已经报道了许多对病原菌有拮抗作用的菌株，尽管拮抗防治菌剂的生产具有投资小、设备要求低等优点，但成功开发和进行商业化生产的拮抗菌却很少。这主要是拮抗菌在应用发展中还存在着一些困难和问题。任何拮抗菌对病害的防治效果，最终都要通过大田应用，大田的气候、土壤温度、湿度、pH值等因素千变万化。任何拮抗菌发挥作用都要在一定的气候与理化条件下进行，不可能适应所有地区和气候条件。因此，在推广应用拮抗菌剂中，应该加大拮抗菌剂最佳作用条件的筛选和创造适合拮抗菌发挥作用的田间条件。目前筛选的拮抗菌只是对某类或某几类病原菌有拮抗作用，限制了其推广应用。在自然界生物进化过程中，具有广泛抗菌谱的拮抗菌并不多，因此，我们在寻找具抑菌谱广的拮抗菌的同时，需要运用现代基因工程技术改造已有的拮抗菌，使之具有更高更强更广的抗菌能力。目前生物菌活性物质对病原菌作用机理上研究比较多，但关于生物防治菌在田间的种群动态、不同田间的生物群落组成、植物组织一病原体．拮抗菌三者之间10 的生态相互作用等的研究还十分匮乏。但最终决定生物防治菌作用的还是拮抗菌与病原菌间的博弈，而对决中生态因子对两者都有作用，对决的结果取决于相互的生态关系。抑菌活性物质分泌量低是生物防治过程中普遍存在的现象，这就造成发酵提取有效成分的酿成很大，使以生产抑菌活性物质的为产品的成本较高。如何降低生产成本、提高活性物质产量及作用效率是推广应用的重要环节。目前生物防治以单一菌剂的施用为主要方式，在施用时间上习惯于见病施用，在与化学农药复配使用上十分有限。在生物防治中更应注重以预防为主，提早施用菌剂，形成肥料与灌溉与农事管理操作相协调的施用方法。生防制剂有它自身的局限性和困难，使其很难作为防治策略短时间得到推广，但科学研究和产品商业化已经取得一些成就，显示这又是一种极具发展前景的防治方法，我们应对此充满信心。如果转基因生物被允许商业化的应用在生物防治的研究，将研发出高效的拮抗菌制剂，大大提高生物防治的效率，同时通过遗传工程等手段，改造拮抗菌，提高关键基因的表达水平或整合入其他拮抗菌基因，可显著提高生物防治的效果。在国外，商业化生产的生物制剂有很多。在温室和大田试验中，小盾壳霉对葛茵下垂病有很好的防治作用，被命名为CnoatIlSWG，通过商业化生产制成可湿性粉剂。绿粘帚霉被广泛用于土传病害的防治，对立枯丝核菌有较强的抑制作用【79。801，。己经被商业化生产【811。哈茨木霉菌株T．22具有较强根部定殖力及稳定定殖力，通过种子处理和土壤沟施可防治番茄根腐病和枯萎病[821。哈茨木霉的一些菌株正在被商品化，例如T．35、BinbaT和SuPrcsieit。灰绿链霉菌菌株K61在欧洲和美国都已商品化，用于防治康乃馨枯萎病、瓜果腐霉等【8孓84】。此外，商业化生产的还有链孢粘帚霉菌株J1446、无致病力的尖链孢霉菌株F047和淀粉枯草芽孢杆菌变种FzB24等【85J。在国外，截止到2010年年底，美国EPA己经获准登记200余种生物农药有效成分、800余种产品，其中以细菌为主要成分的杀菌剂主要是芽孢杆菌属和假单胞菌属，以B．s郴6圮ff(枯草芽孢杆菌)为主要有效成分的有四种，而以P亿“D船疗P(荧光假单胞菌)为主要成分的有两种【86】。日本登记的防治植物病害的细菌农药主要是枯草芽孢杆菌、放射土壤杆菌以及欧式杆菌3种药剂。利用“活体微生物”作为农药的形势越来越好，吸引了全世界几十个国家的大批微生物学者和植保专家积极开发以细菌和真菌等微生物为有效成分的农药。在国内，微生物生态制剂的商品化开发也取得了较大进展。作为主要成分的杀菌剂主要有蜡质芽孢杆菌、荧光假单胞及枯草芽孢杆菌等，代表产品有健根宝粉剂、菜丰灵、保根灵、和台湾宝等，其主要成分大都为枯草芽孢杆菌，主要用 来防治的病害有水稻纹枯病，玉米茎腐病，烟草黑胫病，西瓜枯萎病，白菜软腐病以及棉花苗期病害等。武汉天惠生物工程有限公司已经研制出枯草芽孢杆菌BS．208杀菌剂并获得农药登记，剂型含有活芽主要looO亿(cuf)儋和500亿(cuf)儋的可湿性粉剂和200亿(cuf)儋的悬浮剂，田间防治黄瓜白粉病、草莓灰霉病和草莓白粉病的效果优于化学杀菌剂【87】。在我国中国农业大学陈延熙等(1985)研制的增产菌已在全国十多个省推广使用，主要防治小麦纹枯病和油菜菌核病等，田间增产率达10％．50％【88】。云南农大和中国农大共同研制的微生物农药“百抗”已获得农药部登记注册，己在多个省推广使用。百抗的有效成分是枯草芽孢杆菌B908，对水稻纹枯病防效达70％以上。抑菌机制是营养竞争、位点占领等[891。魏春妹，张春明等(2000)【901研制的生防制剂“青枯散”，对番茄青枯病、烟草青枯病的防治效果分别为70％，80％，并有10％的增产效果，表现出发芽势高和壮苗的作用。此外，多种抗生素生物农药已投入生产并在大田使用，取得了较高的防效，如农抗2．16【91】、农抗120[92】等。Wroohdaed(1990)一3J旨出，研制出一种防治病虫害的微生物制剂要花费500万美元，历时3年。相比之下，研制出一种化学药剂需花费4000一8000万美元，历时8．12年。针对土传病害分布广、危害严重、难以防治以及化学农药的弊病和研制历时长、花费大的现实，生物农药毫无疑问地将受到重视，生产上对防治土传病害的生物制剂需求迫切，所以生物农药的发展前景广阔。12 1引言疫霉菌属于卵菌门疫霉属(砌y鲫，』lz历D阳)菌物，该属中有不少是农作物上的重要病原菌，如大豆疫霉(勋)，鲫砌砌D朋s咖P)、致病疫霉(P切钮勉凇)、辣椒疫霉(尸删筇剃)等，每年给农作物及林木生产带来严重损失。最著名的例子就是1845年爱尔兰发生的马铃薯晚疫病，直接导致百万人饿死，数百万人移民他乡。大豆是我国重要的农作物，种植面积约1．5亿亩，是我国食用油的主要来源，豆油加工的副产品豆粕也是重要的饲料蛋白。我国约有3700万人直接以种植大豆为业，还有大量的人群从事食用油加工和以豆粕为饲料的畜牧业。大豆的种植和加工已经发展成我国巨大的农业产业链条。大豆疫霉(尸sD胁e)侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害⋯，大豆疫病是典型的土传病害，一旦传入，很难根治。最早于1948年发生在美国，1951年在俄亥俄州及不久在美国中西部的其他州也相继发现此病害，当时认为是由镰刀菌(鼢口，．f”m)或间座壳菌(D却D砌P)引致。1955年，该病害病原物在北卡罗纳州发病的大豆幼苗上及俄亥俄州的发病大豆茎部被分离出来，当时认为由恶疫霉(砌y幻砌觑D阳∞c幻Ⅲm)引起的。1958年，Kaufhl锄和Gerd锄aIln对大豆疫霉进行了系统研究后，发现大豆疫霉在形态上与恶疫霉(P叩c幻删m)存在明显不同，将其作为一个新种正式命名为大豆疫霉(Ps咖P)。现已广泛分布亚、非、欧、南北美洲的近二十个国家和地区的大豆主要产区，每年给大豆生产带来的直接经济损失高达几十亿美元，成为大豆生产上最严重的病害。在我国，自1991年沈崇尧等【Io】首次在东北地区发现该病后，现已经在黑龙江、北京、安徽、河南、江苏、浙江、内蒙古、四川、天津等15个省市大豆产区发现此病【11。14J，说明大豆疫霉在我国的大豆产区有较大范围的发生【l引。目前，防治大豆疫霉根腐病的方法主要是化学防治，其中使用最多的药剂是甲霜灵(MetaLaxy，商品名mdomiL)。甲霜灵为内吸性杀菌剂，生物活性强，且持效期长【26】。但其对病菌的作用位点单一，病原菌容易对其产生抗性突变，因此，开发新的防治方法在控制大豆疫霉根腐病上尤其重要【25'2引。为可持续地控制大豆疫病，避免大豆疫病因单一的化学防治而过快地产生抗药性，生物防治己成为大豆疫病防治的重要方法。因此，作者从大豆根围土样中筛选得到对大豆疫霉有较好拮抗作用的生防菌株4株，分离得到一株对大豆疫霉有较好拮抗效果的生防细菌BY-2，对其拮抗效果进行了研究，其对大豆疫霉的平板抑制效果较好，使大豆疫霉菌丝断裂、消解、畸形。通过其培养性状、形态特征、扫描电镜和显微镜观察及16SrDNA序13 列，g徊基因序列对其进行了鉴定，构建了包括其在内的12株相似属菌株的系统发育树和包括其在内的24株相似种菌株的系统发育树。BY-2菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，芽孢染色为绿色。据16SrDNA序列，g、邮基因序列分析与其亲缘关系较近菌株B口c江E“s”6打凰(D0470472)的同源性达99％，因此鉴定BY-2菌株为枯草芽孢杆菌(曰口cf刀螂s动打凰)。经平板测定、对其代谢产物进行不同发酵时间的活性测定，发现其代谢产物能显著抑制疫霉游动孢子的萌发及芽管的生长，对其挥发性物质进行测定发现能显著抑制疫霉菌丝的生长，对离体叶片及盆栽防效也具很好的生防效果，并且能明显的增加植株的干重，鲜重，根长，茎长促进植株的生长。提取其产生的拮抗物质进行理化特性研究，以期为大豆疫霉根腐病防治提供新的拮抗菌资源，也为开发出新型的农药提供基础。本研究课题来源于国家公益性行业(农业)科研专项(3—20)资助项目内容的一部分。14 2材料与方法2．1试验材料供试菌株BY一2，BZ一2，BY．1，BH．1从安徽大豆根围土样中取土分离获得；枯草芽孢杆菌(曰口cfZ屁岱s“6巧凰)BS菌株和哈茨木霉(乃f幽D如册口办口，z妇万“m)TH一1菌株均由安徽农业大学植物病原真菌实验室提供，本试验所采用的供试粉红单端孢(研c^D砌ecf“m，Dse“mLink)菌株来自不同的寄主，其中菌株玳、TrB，由安徽农业大学植物病理教研室提供，寄主为无为棉田病铃；菌株粥由华东师范大学生命科学学院提供，寄主为巨峰葡萄；菌株TrA由西北农林科技大学植保学院提供，寄主为苹果；菌株TrP实验室分离自新疆香梨上的带病组织。表】供试菌株来源和编号nble11’esteds廿ainssource8andnumber2．1．1培养基利马豆培养基(LBA)：利马豆609，琼脂粉159，蒸馏水1000mL。利马豆粉609加水1000mL，在60。C下水浴1h，双层纱布过滤去渣。取上清液补足水至1000mL，加入琼脂159，中于121。c高压蒸汽灭菌20min。利马豆液体培养基：利马豆粉609，15煮沸后持续沸腾数分钟，分装至三角瓶水1000mL。 利马豆粉609加水1000mL，在60℃下水浴1h，双层纱布过滤去渣。上清液补足水至1000mL，煮沸后持续沸腾数min，121℃高压蒸汽灭菌15～20min。LB培养基：胰蛋白胨109，酵母提取物59，氯化钠109，蒸馏水：1000mL，调pH7．0—7．7；去离子水1000mL，沸腾后加入209琼脂，待琼脂融化后双层纱布过滤去渣。上清液补足水至1000mL，分装至250mL的三角瓶中，1210C高压蒸汽灭菌20min。PDA培养基：马铃薯2009，葡萄糖209，琼脂粉159，蒸馏水1000mL；PDB培养液：马铃薯2009，葡萄糖209，蒸馏水1000mL；NA培养基：牛肉浸膏39，蛋白胨59，葡萄糖lOg，琼脂粉159，蒸馏水LooOmL，pH7．0；NB培养液：牛肉浸膏39，蛋白胨59，葡萄糖109，蒸馏水LooOmL，pH7．0；10％V8培养液：100mLV8汁加入CaC0319，在1500转／分下离心10min，得到上清液。2．1．2生化试剂及溶液配制TE绣l冲液(pH8．O)：10mmol／LTrisO．129，O．001mol／LEDTA0．39，冰乙酸调pH8．O，加双蒸水至100mL。TAE电泳缓冲液：O．04mol／LTris4．89，0．001mol／LEDTA0．39，冰乙酸调pH8．0，加蒸馏水至1000mL。TE：10mmol／LTris-HCLpH8．O，O．1mmol／LEDTA。其他试剂：酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，氯仿：异戊醇(24：1)，100mm01／LTris．HCl(pH8．O)，25％戊二醛溶液，20mm01／LEDTA，5mol／LNAcl，10％sDs，20m咖L的蛋白酶K，CTAB／NACl，液氮、异丙醇、无水乙醇、70％乙醇、ddH20、EB染液、1％琼脂糖凝胶。革兰氏染色试剂：结晶紫、草酸铵、碘化钾、碘、蕃红。芽孢染色试剂：孔雀绿、番红。DNAm破erDL5000博美生物试剂公司TaqDNA聚合酶北京鼎国昌盛生物技术有限公司dNTPTaKaRa公司(大连)6×LaodingBu脏rTaK水a公司(大连)SoLutionITaK水a公司(大连)PMD一19TT水aRa公司(大连)PMD—18TTaKaRa公司(大连)16 其它常规试剂为国内分析纯试剂。2．1．3供试仪器EppendorfAG22331PCR自动化分析仪德国印pendollF公司Bio．RadmLuL．Protei皿电泳系统美国Bio．Rad公司MDF．U4086S超低温冰箱日本三洋公司MiL“．QBioceL纯水仪美国MiLLipore公司DYY-11型水平式电泳槽北京市六一仪器厂EC3hna百ngSyst锄美国UVP公司S、肌CJ．2F洁净工作台上海博迅实业有限公司ZPO．350智能人工培养箱黑龙江东拓仪器制造有限公司GXZ．300B型智能光照培养箱宁波江南仪器厂制造恒温培养摇床上海一恒科学仪器有限公司zHwY．103B恒温培养震荡器上海智成仪器制造有限公司LDZX一30I@立式电热压力蒸汽灭菌器上海中安医疗器械厂TGL．16台式高速冷冻离心机长沙平凡仪器仪表有限公司SIGMA3K30高速台式冷冻离心机北京博励行仪器有限公司精密pH计上海雷磁仪器厂DK-8D型电热恒温水槽上海精宏试验设备有限公司XW．80A微型漩涡混合仪上海沪西分析仪器有限公司2．2大豆疫霉生防菌的分离和筛选2．2．1候选菌株的分离方法按照李阜棣等[94】的微生物稀释分离方法，采用单胞分离法：从大豆根围土壤中称取土壤样本19，放入100mL无菌水中，振荡20min后即为微生物悬浮液。分别吸取1mL悬浮液，按照10倍比例梯度稀释后，将102、103、104和105的稀释液各取300此涂布于LB平板上，略干后倒置于培养箱恒温培养后，挑选合适浓度涂布的平板，直接从平板上数菌落，并计算微生物总数。挑选代表性菌落于平板上再纯化，纯化后的微生物分离物接入相应的培养基斜面上培养，保存备用。细菌总数(c纠g)=菌落平均数×稀释倍数×无菌水体积(100mL)／稀释液体积(1mL)×样本质量(19)2．2．2大豆疫霉拮抗菌的筛选采用平板对峙方法，进行初筛，筛选出对大豆疫霉有较好拮抗作用的拮抗菌株，进一步进行离体叶片复筛，在此基础上选择拮抗力较强的候选拮抗微生物用于抗菌谱的测定。17 2．2．2．1细菌的活化和培养将保存的编号为BY．2，Bz．2，BY．1，BG．1，BS细菌于NA平板上重新划线，在28℃条件下，于培养箱中活化24h，待细菌生长后，检查细菌的纯度，并在无菌超净台上用灭菌的接种环挑取单菌落形态一致的纯培养细菌于新的NA平板上划线，培养24h，备用。2．2．2．2细菌的活化和培养将保存的TH．1、TrA、TrB、眦、TrD、啪、TrP菌株接入PDA平板上，25℃黑暗培养2d，备用。2．2．2．3生防细菌BY-1、BH．1、BZ．2、BY-2、BS菌株的平板对峙培养实验生防细菌BY-1、BH．1、BZ．2、BY．2、BS在NA培养基上28℃，活化24h，将活化好的生防细菌，采用平板划线法进行抑菌作用的测定。用接种环取一环生防细菌菌株在LBA平板的中间划一直线，在距离直线两侧2cm处分别接种直径为6mm的病原菌菌碟，并以单独接种病原菌，中间不划线的处理为对照。每个处理重复3次，25℃黑暗培养48h后，测定其抑菌效果。在两接种点的连线上测量病原菌向拮抗菌方向生长的菌落半径和对照组中病原菌的菌落半径(mm)，连续测量4d，并计算抑制率}l¨。抑制率(％)=(对照菌落半径．处理菌落直径)／(对照菌落半径一6mm)×1002．2．2．4粉红单端孢菌株TrA、TrB、玳、TrD、啪平板对峙培养实验粉红单端孢菌株TrA、TrB、№、TrD、TrG在PDA平板上25℃，活化48h，将活化好的生防菌株，采用对峙培养法进行抑制作用测定，分别与病原菌菌株对峙培养接种于平板上，菌碟直径为O．6cm，两菌块接种点相距4．0cm，并以单独接种病原菌的处理为对照，每个处理重复3次，25℃恒温培养，接种后第2d开始观察菌落的相互影响，并在两菌株接种点的连线上测量病原菌向拮抗菌生长的菌落直径，和对照组中病原菌的菌落直径。抑菌率(％)=(对照菌落直径一处理菌落直径)／(对照菌落直径．6mm)×1002．2．2．5粉红单端孢菌株TrP的平板对峙培养实验粉红单端孢菌株TrP在PDA平板上25℃，活化48h，将活化好的生防菌株，采用对峙培养法进行抑制作用测定，分别与病原菌菌株对峙培养接种于平板上，菌碟直径为O．6cm，两菌块接种点相距4．Ocm，并以单独接种病原菌的处理为对照，实验设2个处理，每个处理重复3次，处理1：病原菌与粉红单端孢菌株同时接种，处理2：提前接种疫霉2d后再接种TrP，25℃恒温黑暗培养，接种后第2d在两菌株接种点的连线上测量病原菌的菌落直径，和对照组中病原菌的菌落直径，连续测量7d，计算抑菌率。抑菌率(％)=(对照菌落直径一处理菌落直径)／(对照菌落直径．6mm)×100 2．2．2．6哈茨木霉TH—l代谢液的抑菌效果100mLPDB培养液中接入5块直径6mm的木霉菌碟，并置于25℃，120玎『miIl的恒温摇床振荡培养72h，用4层纱布过滤，得到其孢子悬浮液，5000r／min离心15min，上清液经0．22pm细菌过滤器过滤后，制得木霉的代谢液，取1mL代谢液与19mL的PDA培养基混匀后倒平板，并在平板中央接种直径为6mm的病原菌菌碟，同时设加入1mLPDB培养液的处理为对照，每个处理重复3次，25℃下恒温培养，接种后48h开始测量菌落直径，每隔24h测量一次菌落直径连续测量7d，按以下公式计算抑菌率。抑菌率(％)=(对照菌落直径一处理菌落直径)／(对照菌落直径一6mm)×1002．2．2．7枯草芽孢杆菌BS代谢液对疫霉菌丝生长的抑制将在NA培养基上活化24h的BS菌株取一环，接入NB培养液中，28℃，160印m．min。1振荡培养48h、72h、96h、120h。培养物4℃5000r肺in离心15miIl，上清液用O．22砌的细菌过滤器过滤得到代谢液。分别取不同发酵时间的代谢液1mL与19mL利马豆培养基混匀制成平板，接种直径为6mm的疫霉菌碟至平板中央，以用无菌水作对照，重复3次，于25℃黑暗培养3d后，测量对照菌落直径和处理菌落直径，计算抑菌率。抑菌率(％)=(对照菌落直径一处理菌落直径)／(对照菌落直径．6I砌)×1002．2．3BY-2代谢液对大豆疫霉的抑菌作用测定将拮抗菌株在NA培养基上活化培养24h后，取1环菌苔接种于100mLNB培养液中，28℃、160r·min。1摇床上分别振荡培养48h，72h，96h，120h；培养液经4℃、5000r·min‘1离心15min，上清液用O．22¨m的细菌过滤器过滤得到代谢液。取1mL代谢液与19mL利马豆培养基混匀制成平板，在其中央接种直径为6mm的疫霉菌饼，以用无菌水作对照，重复3次，于250C黑暗培养3d后，测量拮抗菌株对疫霉菌的拮抗直径，计算抑菌率。抑菌率(％)=(对照菌落直径．处理菌落直径)／(菌落直径一6mm)×1002．2．4BY-2代谢液对大豆疫霉游动孢子萌发的抑制供试大豆疫霉菌株在LBA平板上生长5d后，按郑小波【6】的方法诱发产生孢子囊得到游动孢子悬浮液。取15mL游动孢子悬浮液(浓度为2．13×104cm．mL-1)分别与10mL拮抗细菌BY．2代谢液在培养皿内混匀，用等体积的NB培养液代替BY-2代谢液为对照，于250C黑暗培养；处理后8h、12h、16h和24h分别镜检孢子萌发情况，以芽管长度超过孢子直径l／2作为萌发标准，每处理5个视野，每个视野观测20．30个游动孢子，计算孢子萌发抑制率。孢子萌发抑制率(％)=(对照孢子萌发率．处理孢子萌发率)／对照孢子萌发率×10019 2．2．5BY-2挥发性产物对大豆疫霉的抑菌活性测定在一培养皿中倒入15mLLBA培养基，待其冷却后在平板中央接种直径6mm的疫霉菌碟，另一培养皿中倒入15mLNA培养基，冷却后划线接种BY-2，将两培养皿对扣用封口膜密封；以NA培养基上不划线接种BY．2为对照，5次重复，置25℃培养箱内黑暗培养，3d、5d、7d后分别测定菌落生长直径，计算抑菌率。抑菌率(％)=(对照菌落直径．处理菌落直径)／(对照菌落直径一6mm)×1002．2．6生防菌株活菌液对大豆疫病的离体防效测定选择生长整齐的大豆植株，采集大小一致的健康叶片，自来水冲洗干净，70％的酒精表面消毒30s，无菌水冲洗2min，晾干。将拮抗菌株在NA培养基上活化后，接种于NB培养液中，28℃下150r．min‘1振荡培养7—8h，获得各菌株的活菌液，调节浓度至108c血．mL-1。将大豆叶片在菌液中浸泡1min，取出自然晾干，接种直径为6mm的大豆疫霉菌饼。以无菌水为对照，每个处理重复5次。接种完毕，置于25℃、相对湿度90％的光照培养箱内黑暗培养，48h后测量病斑直径，计算防治效果。防治效果(％)=[(对照病斑直径一处理病斑直径)／对照病斑直径]×1002．2．7生防菌对大豆疫病的盆栽防效试验大豆疫霉菌株在LBA上培养5d后，取菌碟于V8培养液中培养，按郑小波【llJ的方法诱发产生孢子囊，得到游动孢子悬浮液；取30mL游动孢子悬浮液(浓度为2×104c血．mL‘1)分别与15mL拮抗菌液(浓度为108c向·mL。1)混合，加水稀释至150mL，将4～6片叶的大豆幼苗(品种为合丰35)从育苗盆中轻轻拨出，放入菌液中浸根处理2h，然后将幼苗移栽于育苗盆中；对照用无菌水代替拮抗菌液，试验共设3个处理，分别为：BY-2菌液提前3d浸根后接疫霉游动孢子悬浮液；BY-2菌液、疫霉游动孢子悬浮液同时接种；对照为疫霉游动孢子悬浮液单独接种；每盆6株苗，每个处理3次重复，置温室内管理。病情调查在接种后10d进行，分别计算各处理发病率、病情指数和防效。严重度分级标准一5】：0级：幼苗茎部和主根上均无病斑；1级：茎基部和主根上有病斑，病斑面积占茎部和主根总积的1／4以下；2级：茎部和主根上病斑面积占茎部和主根总面积的1／4．1／2左右；3级：病斑占茎部和主根面积的l／2以上；4级：茎基部和主根上病斑连片，已形成绕茎现象，但根系并没坏死；5级：地上部萎蔫或枯死。发病率(％)=(发病株数／总株数)×10020 防治效果(％)=[(对照发病率一处理发病率)／对照发病率]×1002．2．8生防菌液对大豆幼苗的促生作用的测定供试大豆品种为合丰35，采用营养钵种植方式，每盆装2509灭菌土，每盆播种8～10粒种子，常规管理，定苗6棵。待幼苗长至4～6片叶时，每株用15mLBY-2活菌液(菌液浓度为1×108c如·mL。1)灌根，以清水处理作对照，4次重复。接种20d后调查大豆的生长状况，测定豆苗根长、茎长、鲜重、干重，计算生物量增加率。生物量增加率(％)=(处理组鲜重一对照组鲜重)／对照组鲜重×1002．3生防菌株的鉴定2．3．1生防菌株的菌落形态形态学主要指菌落形态、液体培养生长情况及细胞个体形态和微生物细胞的超显微结构等，细菌形态学包含菌落形态学和细胞形态学。分离纯化过程中，在NA培养基中28℃培养24h后，纯培养单茵落时，注意观察其菌落形态特征，包括其形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、湿润或干燥、光滑或粗糙、菌落及培养基的颜色等。菌落产生的色素和气味也归属于菌落形态学。细菌形态学检查是最基本、最简单、最快速的常规鉴定方法。细菌形态学正确描述依赖于方法、培养基、培养时间、染色试剂等，培养基和培养时间不同会影响细菌的形太J【：一o2．3．2生防菌株的个体形态2．3．2．1革兰氏染色采用草酸铵结晶紫染色法。一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法：细菌涂片固定后，草酸铵结晶紫染色剂染色1min，水洗；碘液处理Lmin水洗，用吸水纸吸去水分；95％酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分；蕃红染色液复染10秒钟后，水洗，待干燥后，镜检。若菌体呈紫色，则为革兰氏阳性菌；菌体呈红色，则为革兰氏阴性茵。2．3．2．2芽孢染色采用孔雀绿染色法。取一干净载片，在载片中央加一小滴水，按无菌操作取少量菌体混合均匀，制成涂片，风干固定后，在涂菌处滴加7．6％的孔雀绿饱和水溶液，间断加热染色10min后(注意添加染液勿使涂片干燥)，用水冲洗。再用O．5％蕃红液染色1min，水洗，自然干燥后镜检。芽孢被染上绿色，营养体呈红色。2．3．2．3扫描电镜样品的制备和观察将在NB培养液中培养24h的菌液取lmL，放入7mL的离心管内，8000呻，3—5min；用pH7．2的PBS缓冲液清洗3次，吸2mL，0．1mol／L，pH7．2的磷酸缓 冲液(包含Na2HP04·12H20，Na2HP04·2H20)放入7mL离心管内，4℃固定过夜；用30％一50％．75％_85％一95％酒精梯度脱水15min(在4。C冰箱中进行)；超净台吹干成粉末状即可拿去镜检。2．3．3生理生化性状测定(1)氧化酶测定1％二甲基对苯二胺盐酸盐或1％四甲基对苯二胺盐酸盐，方法：在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3—4滴新鲜试剂使滤纸湿润，不可过湿，用牙签挑取18—24h的菌苔涂抹在滤纸上，若在10s内涂抹的菌苔现紫色为阳性反应，一般在60s后变色或一直不变色的为阴性反应。(2)过氧化氢酶测定取一环细菌到干净的载玻片上，滴加3％过氧化氢，产生气泡为阳性反应，不产生气泡为阴性反应。(3)明胶液化明胶1209，牛肉浸膏3．09，蛋白胨5．09，蒸馏水1000mL，每支试管5mL，121℃灭菌15min，取24h的斜面培养物穿刺接菌，并有两支未接种的试管做空白对照，此后3d，7d，10d，4℃放置30min观察，若明胶水解为阳性，不水解为阴性。(4)接触酶反应NA平板上生长24h培养的细菌，用接种环挑取一小环菌苔涂布于含有3％过氧化氢的玻片上，立刻或1s内出现大量气泡则为快速反应，1s后缓慢出现气泡则为迟缓反应，无气泡产生则为阴性反应。(5)苯丙氨酸解氨酶将待测菌株接种于培养基(酵母膏39，NaCI59，Na2HP04lg，琼脂129，L一苯丙氨基酸29，蒸馏水1000mL，pH7．O，分装试管，121℃湿热灭菌20min)斜面，28℃培养8．24h，取4．5滴10％FeCl3滴到斜面上，当斜面上和冷凝水中产生绿色时为阳性，不变色为阴性。(6)淀粉水解蛋白胨10．Og，牛肉浸膏3．Og，可溶性淀粉2．09，蒸馏水1000mL，pH=7．O，121℃灭菌20min，倒平板备用，将菌株点种于上述平板，适温培养，培养2．5d，形成明显菌落后，在平板上滴加(革兰氏碘液)呈蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解阳性，仍是蓝黑色为阴性。(7)需氧性测定蛋白胨29，NaCl59，K2HP0429，琼脂5—69，葡萄糖109，蒸馏水1000mL，分装试管，培养基高度4．5cIIl，121℃灭菌15min，将培养24h的细菌用接种针穿刺接种到培养基管底，3d后观察结果，如果菌落沿培养基表面生长，表明为好 氧菌阳性，如果沿刺线生长，表明为厌氧菌，为阴性。(8)吲哚产生将待测菌株接种于蛋白胨水培养基(1％胰蛋白胨水溶液，pH7．2—7．6，每管5mL，115℃灭菌30min)中，放置28℃培养箱内培养24．48h，在培养液中加入乙醚约1mL，充分振荡使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，待乙醚层浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚试剂10滴，如有吲哚存在，则乙醚层呈现玫瑰红色。(9)柠檬酸盐的利用将待测菌株在斜面(培养基：NaCI19、MgS04．7H200．29、NH4N0329、K2HP040笃g、柠檬酸钠29、琼脂209、蒸馏水1000mL、调pH值至6．8—7．0，加0．04％酚红溶液1mL，分装试管，在121℃下湿热灭菌20min)上划线，28℃培养3．7d，含酚红的斜面红色者为阳性，黄色为阴性。(10)丙二酸盐的利用将待测菌株接种于丙二酸盐液体培养基中(丙二酸钠39，酵母粉19，NaCl29，硫酸铵29，K2HP040．69，KH2P040．49，溴百里酚蓝0．0259，水1000mL)，室温培养2d，培养基由绿变蓝者为阳性，若培养基不变色者为阴性。(11)硝酸盐还原反应将待测菌株接种于硝酸盐液体培养基中，置28℃下培养ld、3d和5d，以不接菌作对照，分别取O．5mL培养1d，3d，5d的培养液倒入2支灭菌的试管中，各加1滴格理斯I、II，培养基中滴入I、II液后，溶液如变为粉红色、玫瑰色、橙色、棕色等表明培养基中含有亚硝酸盐，硝酸盐还原反应为阳性。如无红色出现，则可加一滴二苯胺试剂，如溶液呈蓝色，表明不发生硝酸盐还原作用，硝酸盐还原反应为阴性。如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的硝酸盐都已还原成其他物质，故应按硝酸盐还原阳性处理。(12)V．P测定将待测菌株接种于V-P培养液中，置于28℃下培养2d；取培养液和40％NaoH等量混合，加10mg肌酸，30．60s后，如有红色出现，即为V-P阳性反应，否则即为阴性反应。(13)耐盐性测定NA液体培养基中分别加入NACl，配成浓度5％，7％。采用直接接种，以空白培养液为对照，28℃下培养7～14d，记录菌株的生长情况，设未接菌的为空白对照。(14)葡萄糖氧化发酵试验蛋白胨29，NaCI59及K2HP0429，葡萄糖109，琼脂69，1％溴百里酚蓝水溶液3mL，蒸馏水1000mL。分装试管，培养基高度为4．5cm，121℃灭菌15min将培养24h的待测细菌穿刺接种于休和利夫森二氏培养基，其中两管用灭菌的凡士林石蜡油封盖，厚度1cm，另两管不封盖，同时设不接种的闭管及开管做对照。 培养一定时间后观察结果，只有开管产酸变黄者为氧化型，开管闭管均产酸变黄者为发酵型。(15)H2S产生培养基：蛋白胨19，NAClO．59，牛肉膏0．759，明胶10～129，FeCl2微量，蒸馏水loog，pH7．O穿刺接种，30℃培养，第1、3、7d观察培养基颜色变化。(16)酪氨酸水解将酪氨酸0．59悬浮于10mL蒸馏水中，115℃，灭菌20min，于100mL无菌的营养肉汤琼脂混合，倾倒平板，待凝固后，将测试菌接种于平皿上，培养7到14d，记录酪氨酸结晶是否被水解而变透明。2．3．4两株生防细菌的16SrDNA、gyrB序列分析2．3．4．1细菌总DNA的提取(1)选出形态区别明显且抑菌效果较好的若干菌株，在NA平板上划线分离；放在37℃恒温箱中培养24h；用接种环取单菌落，接入LB液体培养基中，并在管壁轻轻磨擦几下；(2)37℃，180印m恒温摇床中过夜培养的细菌培养物至饱和状态，取1．5mL的培养物10000印m离心3min弃上清；(3)沉淀物加入567止的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入30此10％的SDS和3肛L20mg／mL的蛋白酶K，混匀，与37℃温浴1h；(4)加入100pL5m01／L的NACl，充分混匀，再加入80此CTAB／NaCl溶液，混匀，于65℃温浴15min；(5)加入的等体积的氯仿／异戊醇(24：1)，混匀，12000印m离心10min，将上清液转到一个新管中，如果难以移出上清，先用牙签去除界面物质；加入等体积的酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)；混匀，12000叩m离心10min，将上清液转入另一支新管中；(6)加入1倍体积无水乙醇，轻轻混合．20℃、30min直到DNA沉淀下来，然后12000叩m离心10min，将沉淀转移lmL70％乙醇中洗涤；12000rpm离心15min，弃上清，用超净工作台稍加干燥，重溶于50此的TE缓冲液。取2皿上述提取的DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。2．3．4．216SrDNA的PCR扩增根据细菌16SrDNA的结构特点及其保守区设计特异引物，设计引物序列如下正向引物T27F：5’一AGAGTTTGATCATGGCTCAG．3·。反向引物Tl541R：5’．AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3’，由英骏生物技术有限公司合成并提供。PCR反应程序：94℃预变性4min，94℃变性45s，60℃退火45s、72℃延伸 1min40s，34个循环，72℃延伸10min，25℃保存。表2．16SrDNAPCR反应体系!垒!!丝：!!兰坐型垒呈g圣：型竺翌型堕竺细菌DNAl“LTaqDNA聚合酶0．25此dNTP10xPCRbuf凫rT27FT1541R总体积25止2．3．4．3g徊的PCR扩增(1)正向引物UP．1：5t—GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA(TC)GC(TCAG)GG(TCAG)GG(TCAG)AA(AG)TT(TC)GA．3’(2)反向引物UP一2r：5tAGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC(AG)TC(TCAG)AC(AG)TC(TCAG)GC(AG)TC(TCAG)GTCAl’-3’，由上海生工生物工程有限公司合成提供。表3gyrBPCR反应体系1曲le3．gyrBPCRre∞tionSyst啪细菌DNA2pL1’aqDNA聚合酶0．25皿dNTP2此lOxPCRbu虢rUp-1Up-2r2．5此0．5“L0．5nLddH，0l7．25pL总体积25此扩增条件为94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，31个循环；72℃延伸10min，取2uL用1．0％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行电泳检测。2．3．4．4PCR产物的电泳检测采用琼脂糖凝胶(1％，w，v)电泳分离所提取的DNA，用溴化乙锭溶液染，L止批狲脚嘶泌 色胶块，在凝胶成像仪中观察DNA片断大小。2．3．4．5PCR产物的回收和纯化在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，(提起记录1．5mL离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg=100此)；加入3个凝胶体积的Buf衔DE．A，混合均匀后于75℃加热(低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热)间断混合(每2．3min)直至凝胶块完全熔化(约6—8min)；加0．5个Bu脓DE．B，混合均匀，当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。；吸取步骤(3)中的混合液，转移到DNA制备管(置于2mL试剂盒内提供离心管)中12000rpm离心lmill，弃滤液。将制备管置回2mL离心管，加500此Bu鼠rWl，12000印m离心30s，弃滤液。将制备管置回2mL离心管，加700此Buf|ferW2，12000rpm离心30s，弃滤液，以同样的方法再用700¨LBuf|衙W2洗涤一次12000rpm离心1min；将制备管置回2mL离心管中，12000印m离心1min。将制备管置于洁净的1．5mL离心管(试剂盒内提供)在制备膜中央加入25—30此去离子水室温静置lmin，12000印m离心1min，洗脱DNA。2．3．4．6目标DNA片段的克隆表4目标DNA连接的反应体系(10此)1’able4Ligation町，st啪ofaimedDNA(10止)s01utionIPCR产物PMD一18T载体5uL4此luL总体积10此轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心，12℃放3小时，4℃过夜。2．3．4．7大肠杆菌DH5a感受态的制各(采用CaCl2法)划线培养DH5a单菌落；挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于3mLLB液体培养基中；37℃120．150印m振荡培养过夜(轻缓振荡)；取该菌液以l：100接种于10mL新鲜LB培养液中；37℃180—200印m振荡培养2．4h，至培养液A260=O．4．0．6；将菌液移到灭菌的EpIpeIldorf管中，1mL／管，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃，12000印m，离心1min；沉淀中加入预冷的0．1mol／LCaCl2500pL／管，悬浮，冰浴中放置20min，12000印m，离心1min，弃上清；沉淀中加入预冷的O．1mol／LCaCl2100“L／管，悬浮，30min后使用，余者冻存于一70℃。2．3．4．8连接产物DH5a×E．coiL(大肠杆菌感受态)冰上熔化，加入PMD一18T连接液10此，于菌液中混匀(手指轻轻弹匀)；放置于冰上30min(预热LB液于37℃水浴锅26 中)；混合液放入42℃热击50．90s，(50s即可)热击时不要晃动；再将其置冰上5min；加预热的LB液800此；37℃、160印m震荡培养40min；4000rpm离心4min，倒去上清液，剩下200此左右；将剩下的200止菌液悬浮混匀，再涂平板(Amp板；将板子倒置于37℃，培养菌过夜。2．3．4．9连接产物的转化筛选单菌落，用灭菌的白枪头从单菌落中挑取少量细菌做模板进行PCR反应；反应体系和程序同前；反应结束后取10此PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以检测是否有相应大小的条带。2．3．4．10连接产物的鉴定用无菌牙签挑取单菌落接种于含50“g／mLAmp的2mLLB液体培养基中，37℃下振荡培养8．12h，待菌液浑浊即可拿去测序。2．3．4．1116SrDNA、g徊序列分析PCR产物由上海英骏公司测序，在NCBI网站(h郇／／mvw．ncbi．nLrn．nih．gov)上分析BY．2、BZ．2的16SrDNA、gyrB序列。用BLAST2．0软件对数据库中已有的细菌16SrDNA序列进行相似性比较分析。采用PAUP4．O软件，对BY．2、BZ．2的16SrDNA、gyrB序列与已报道的枯草芽孢杆菌的序列进行多重序列比对，构建系统进化树。2．4枯草芽孢杆菌BY．2的生物学特性测定2．4．1温度对菌株生长的影响接种O．5mL振荡培养24h的细菌液(1×108mL)于100mL培养液中，分别置15℃、20℃、24℃、28℃、30℃、32℃、37℃、40℃、45℃，180印m条件下振荡培养24h，每处理重复3次，以不接菌培养液为对照，用紫外分光光度计测定OD600的值。2．4．2PH值对菌株生长和繁殖的影响用1m01／LHCI和1m01／LNaOH将NB培养基的初始pH值分别调至4、4．5、5．O、5．5、6．0、6．5、7．0、7．5、8．0、8．5、9．0、9．5和10。接种0．5mL振荡培养24h的细菌液(1×108mL)于盛有100mLNB培养液的容量为250mL的三角瓶中，30℃，180rpm振荡培养24h，测定OD600的值。2．4．3培养时间对菌株生长的影响将培养24h的菌株接种在100mLNB培养液中，30℃，180岬条件下振荡培养12h后取样，24h，48h，96h，120h每隔12h各取样一次，测OD600值。2．4．4菌株最适接种量的筛选27 菌株最适接种量的筛选各取种子培养液分别接种于100mL培养液中，即按不同的接种量O．5％，1％，2％，2．5％，3％进行接种30℃，180印m振荡培养48h，测定OD600的值。 3结果与分析3．1大豆疫霉生防菌株的分离筛选3．1．1拮抗细菌的分离从安徽省怀远发生大豆疫病的大豆田大豆根围土样中分离筛选得到对大豆疫霉有很好拮抗效果的生防菌株4株。3．1．2生防菌株对大豆疫霉的平板拮抗作用测定经不同批次的平板对峙实验，从分离得到的菌株中筛选出对大豆疫霉有很好拮抗效果的生防菌株4株，结果见下表(表1．表5)表明供试拮抗菌株对大豆疫霉均有很好的抑制，在对峙培养第5d时，生防菌株BY．2、BZ．2、BY．1、BH．1、BS对大豆疫霉的抑制率分别为：79％、63．97％、48．75％、47．06％和41．82％，其中以BY．2的抑制作用最强，可以从(图1)看出BY．2菌株造成菌丝的消解、溶化抑制菌丝的生长。表1．生防菌株BY_2对大豆疫霉的平板拮抗效果测定1曲le1．IIlllibito珂activityofbiocon仃olstrainBY-2againstPsQ，口e加vffm 表2生防细菌菌株Bz．2对大豆疫霉的平板拮抗效果测定1’able2．Inhibito巧activityofbiocon廿ols仃ainBZ一2againstP咖．Il抽D，口sQ，口P砌订f，移AHl9SDl91HN24处理对照抑制率处理对照抑制率处理对照2．835．0043．40％4．675．006．60％3．173．504．679．5851．25％6．679．8331．84％5．337．585．3314．7963．97％7．6713．7544．21％6．5011．585．6718．0068．50％8．0017．8355．15％6．6715．33抑制率9．43％31．08％43．90％56．51％表3生防菌株BY-l对大豆疫霉的平板拮抗效果1曲le3．IIlIlibitoD，actiV畸ofbiocon仃Dls订ainBY_1againstP，吵叩．jI肪D阳sQ廊ef疗vf抛不同处理时间的菌落半径(mm)病原菌菌株S仃ains项目It锄Colongs锄idi锄etcratdiff幻lttimeaRcr臼reanllent3d4d5d6dAHl9SDl91HN24处理对照抑制率处理对照抑制率处理对照3．675．7536．17％3．833．9234．8l％3．834．505．0010．8353．86％6．3310．7541．12％6．508．678．5016．5848．75％8．3315．4446．05％10．0013．429．1718．8351．32％9．1718．0049．06％10．6717．50抑制率14．89％24．99％25．46％39．03％30 表4生防细菌菌株BH．1对大豆疫霉病菌的抑制效果病原菌菌株SⅡainsAHl9SDl9lHN24不同处理时间的菌落半径(mm)项目Colongs锄idiameteratdiff．er∞ttime瓶er仃ea仰∞tIteIll—————————————————————————一处理对照抑制率处理对照抑制率处理对照3d4d5d6d5．006．0817．76％4．255．9228．15％4．004．677．8311．3330．92％7．5010．8330．78％7．679．1711．517．7l35．06％9．0015．5847．06％10．3314．6311．6719．1739．12％9．oo17．OO42．26％lO．3318．75抑制率14．28％16．32％29．37％44．91％表5．枯草芽孢杆菌菌株BS对大豆疫霉病菌的抑制效果病原菌菌株S仃ains项目It锄不同处理时间的菌落半径(mm)3d4d5d6d处理4．757．1710．5011．35对照6．5011．0616．0018．50AHl9抑制率26．92％35．17％34．38％38．65％处理5．257．509．509．25对照6．089．9214．42l8．38SDl9l抑制率13．65％24．40％34．12％49．67％处理4．507．008．008．25对照5．759．5013．7517．25HN24抑制率21．74％26-32％41．82％52．17％ 图1．BY-2对疫霉菌丝生长的抑制作用a：拮抗菌抑制生长的菌落b：正常菌落F蟾1．IIlllibitofye腧tofBY．2onnlemyceliagrowthofP艘，口Pa：Colonyi11llibit酣by锄ta90nisticbac吲a；b：NomalColony．图2．BY-l对疫霉菌丝生长的抑制作用a：拮抗菌抑制生长的菌落；b：正常菌落Fig2．Inhibito搿e眠tofBY-lonmemyceliagrowIllofP观胁ea：Colonyi11llibi涮by柚魄onisticbact耐a；b：NomalC010ny．图3．BH-l对疫霉菌丝生长的抑制作用a：拮抗菌抑制生长的菌落；b：正常菌落Fig3．IIlllibitoryeff＆tofBH·l∞memyceliagrowmofPs咖Pa：C010nyiIlllibitedby锄tagonisticbact耐a；b：No咖alColony．32 图4BS对疫霉菌丝生长的抑制作用a：正常菌落：b：拮抗菌抑制生长的菌落；F培4．IIlllibitoryem；ctofBSontllernyceliagrowIllofP叫北a：NonnalColony；b：ColonyiIlllibi湖by柚tagonisticbact耐截3．1．3粉红单端孢对大豆疫霉的平板抑制作用测定结果表明，粉红单端孢菌株TrA、TrB、眦、TrD、nG、TrP菌株对供试病原菌的菌丝生长均有一定的抑制效果，以TrB接种4d时供试病原菌的菌丝生长抑制效果最好达到32．5％(图5)；TrP菌株、疫霉同时接种的抑菌效果明显高于接种疫霉2d后再接种TrP，第7d时的抑制效果达到47．93％(表6，图6)。35．00％30．00％，、25。00％譬。20．0096黠15-Oo％妞15-Oo％喜10．00％5．00960．00％七ratrbtrctrdtrg生防菌株图5．不同粉红单端孢菌株对疫霉菌丝生长的抑制作用Fig5．hlhibitione腧ctofdifj衙∞t胁^D抽ecmm，D蹦‘ms仃ainont}Iemyceliagro砌ofP叫沈 表6．不同处理时间下生防菌株唧对大豆疫霉的平板抑制效果1’able6．Illllibitoryrateofbiocon缸Dlsn面n1岫atdia衲lttimeaRer仃e釉entagainstPs巧口PCK1却Trp+2d疫不同处理曼间菌落直径抑制率菌落直径(cm)抑制率菌落直径(cm)抑制率(d)(cm)(％)注：同列数据后不同小写字母表示在O．05水平上差异显著Note：vaLuesfollowcdbydi腩r朗tsmaLLLett懿wi也inacoLl咖aresi弘访c如tLydi脓r∞tatO．05LeVel．111es锄ebelow5040苎30{j}卜{圈20年喜L00图6．不I司处理时I司粉红单端孢1岫的抑西军Fig6IIllIibitoryrateofbiocon仰ls口ain1砷atdi虢rent妇1eafIer仃eatIIlent注：1岫·表示接种疫霉2d后再接种丁rP3．1．4枯草芽孢杆菌BS代谢液对大豆疫霉的的抑菌作用测定结果表明枯草芽孢杆菌BS不同发酵时间的代谢液对供试病原菌的菌丝生长均有一定的抑制效果，以96h代谢液对供试病原菌HN24的菌丝生长抑制效果较好；枯草芽孢杆菌Bs96h代谢液对供试病原菌HN24的抑制效果显著高于其他各菌株，抑制效果达到32．66％(表7，图7)。 表7．枯草芽孢菌株菌株BS代谢产物对大豆疫霉的抑制效果1、able7．111llibitory删啊够ofmetabolicmctsofstra赫BsagainstP叫船注：同列数据后不同小写字母表示在O．05水平上差异显著Note：Valu嚣followcdbydif勋即t锄alllctt哪withiIlacol啪哦si弘ifi伽1tlydif妇锄tatO．05level．111e锄ebelow摹褂}匿幸告48了2日寸|、司(d)96120图7．枯草芽孢菌株菌株BS代谢液对大豆疫霉的抑制效果Fig7．InhibiaD可ac￡ivityofme拓lbolicp蚤0ductsofs打ainBSagainstP跏3．1．5哈茨木霉菌株TH．1代谢液对对大豆疫霉的的抑制效果结果表明哈茨木霉菌株TH．1代谢液对供试病原菌的菌丝生长有一定的抑制效果，第3d时对大豆疫霉的抑制效果最好；哈茨木霉菌株TH．1代谢液处理第3d时对供试病原菌的抑制效果显著高于其他各处理，抑制效果达到13．6％(表8，图8)。35∞％∞巧加坫如5O 表8哈茨木霉菌株TH．1代谢液对大豆疫霉的抑制效果菌落生长时间(d)处理菌落直径(mm)CK菌落直径(mm)抑制率(％)2345678时问(d)图8．哈茨木霉菌株TH．1代谢液对大豆疫霉的抑制效果Fig8．Inhibito巧e仟ectofthenuidmetabolismof胁而D出册口．jl口，z胁聊magainstgrowthofP叫船3．2BV2代谢液对大豆疫霉菌丝生长的抑制作用结果表明，BY．2不同发酵时间的代谢液对供试病原菌的菌丝生长均有一定的抑制效果，以72h代谢液对供试病原菌的菌丝生长抑制效果最好；BY-272h代谢液对供试病原菌AHl9的抑制效果显著高于其他各菌株，抑制效果达到40．93％(表9)；显微镜结果(图9)显示，对照组菌丝正常生长，而代谢液处理的菌丝体均发生不同程度的畸形变化，BY-2代谢液处理的菌丝体变得粗大，弯64208642Ol一％)碍缸暴 曲形成分隔，菌丝体内原生质聚集成块；病原菌菌丝发生断裂、溶解、畸形、等菌丝现象。表9．菌株BY_2代谢产物对大豆疫霉的抑制效果1’able9．Inhibito哆activi锣ofm颤bolicproductsofS仃aillBY乏againstPs咖e不同发酵时间BY-2代谢液的抑制率(％)供试菌株S仃ainsIIlllibito巧rateofBY二2atdi任hcIltculturefil仃atetime48h72h96h120hAHl930．56a40．93a5．20b3．95bSDl9116．12c23．90b11．70b8．56bHN2424．50b30．69b28．74al9．87a图9．BY-2对疫霉菌丝的抑制作用a：对照菌丝；b：菌丝畸形；c：菌丝肿胀；d：菌丝断裂。F谵9．IIlllibit0呵e腩ctofBY_20ntllemy嘲iagrowdIofP咧口Pa：Con扛01hyph∞；b：nehyphaw鹤maltonned；c：111ehyphaw船swoll饥；d：nlehyphaw勰丘删·3．3BY-2代谢液对大豆疫霉游动孢子萌发的抑制作用试验结果表明，BY-272h代谢液无菌滤液能显著抑制游动孢子的萌发，培养滤液处理8h、12h、16h、24h的孢子萌发抑制率分别为53．09％，39．89％，53．14％和57．71％(表10)。37 表10BY_2代谢液对大豆疫霉游动孢子萌发的抑制作用Table1OInhibitionofBY-2metab01ic1iquidagainst廿1ege肿inationofmezoosporesofPs巧口e处理Treatnlent对照Contml萌发抑培养时间Incubationtlme爵夏甄镜}5磊数萌发率萌发数镜检总数萌发率制率GeminatioTestedGcnninatiG踟nin撕oTcstedGc丌IlinatiInhibitornnunlbertotalonrate(％)nnumbertotalonrate(％)yrate(％)8h4110738．3210713181．6853．0912h16h605l12213249．1838．6411712714315481．8282．4639．8953．1424h4613833．3311915178．8157．71图10BY-2代谢产物对疫霉游动孢子萌发的抑制a：代谢液处理-b：对照Fig10．IIlllibitionofBY-2metabolitesproductionagainstthegernlinationofthezoosporesa：1砌ed、斩thmetabolitesproduction；b：Conn．013．4BY_2挥发性产物对大豆疫霉的抑菌活性结果表明，BY-2挥发物处理对供试病原菌的菌丝生长均有显著的抑制作用，不同菌株和不同时间的抑菌率有显著差异，其中对AHl9第7d时的抑制率最高，高达91．94％，显著高于其他各菌株(表11，图11)显微观察发现，经挥发物处理的菌丝均发生不同程度的畸形、膨大，肿胀，菌丝内部原生质明显褐化，聚集成块；对照菌丝正常生长。表11．BY-2挥发物的抑制效果测定Table11．In}libitoUact谢够ofvolatiles仔omBY-2againstP卿船invi仃oSDl9lHN24AHl973．08ab55．84b81．18a80．69ab76．71b85．43a81．70b84．64ab91．94a38 图11BY-2挥发物的平板抑制效果a：BY-2挥发物处理；b：对照Fig11．ITlllibitoUacti“tyofvoLatiLes行omBY-2againstPsQ，口ein、，i仃oa：Treated诵mvolatilesf．romBY-2：b：Conn．ol3．5生防菌活菌液对大豆疫病的离体防效离体测定结果表明，48h后对照发病严重，叶片上产生水渍状病斑，72h后叶片腐烂。在测定的多个菌株中，不同菌株的防病效果存在较大差异，离体大豆叶片经不同生防菌株活菌液浸叶处理后，接种大豆疫霉所致的病斑直径显著小于对照，不同生防菌株活菌液浸叶处理病斑直径间差异显著，生防菌活菌液浸叶处理离体防治效果在32．89％～63．38％；其中以BY-2活菌液浸叶处理的防治效果最高(表12图13)。表12．离体叶片菌悬液对大豆疫霉的防效测定Table12Con的1emcacyofmebact耐alsuspensionagainstPJQ加Pondetachedleaves39 706050争。随30辛告20100BY一2BH-1生防菌株Bz一2BY一1生防菌株图12．离体叶片菌悬液对大豆疫霉的防效测定Figl2Controle衔cacyofmebacterialsu印ensionagainstPsQ加eondetachedleaVes图13．离体叶片菌悬液对大豆疫霉的防效测定a：处理：b：对照：c：培养基块Figl3．Con仃ole伍cacyofthebact丽alsuspensionagainstPsQ向eondetachedleaVesa：treated；b：control；c：culmremedium3．6BY-2菌株对大豆疫病的盆栽防效盆栽试验结果(表13，图14)表明，生防菌活菌液浸根处理对大豆疫病有较好的防治效果，但不同处理问防病效果存在显著差异；接种10d后调查，BY-2活菌液提前3d浸根的防效显著高于BY_2菌液和疫霉游动孢子悬浮液同时接种处理，防效为75．01％。表13生防菌BY_2对大豆疫病的盆栽防效Table13．Con仃ole行ectSofBY-2strainonsoybeaJlP．叫卵iIlpotexp嘶ments注：BY-2+表示提前3d接种；Note：lIladv如ce3dinoculationBY_2 Fi914生防菌BY之对大豆疫病的盆栽防效Fig14C伽h试e眠tsofbiocon仃olS仃ainsonPsQ，口Pbypot懿p舐m∞ts3．7BY2菌株对大豆幼苗的促生作用结果(表14)表明，BY-2菌液处理可显著地促进大豆幼苗的生长：处理的鲜重、干重都显著地高于对照，BY-2菌液处理的干重、鲜重分别比对照增加了63．16％、43．48％，根长和茎长也都显著高于对照，分别比对照增加56．57％、6．95％，由此可见生防菌液灌根能显著增加植株的干重、鲜重、根长和茎长，能显著促进植株的生长。表】4．BY乏灌榻接种对大豆幼苗的促长作用测定1’able14．PromotiIlge腩ctsofBY．2s仃aill∞megrowof删ib啪sccdlingCK10．27b—1．9b—O．46b一24．60b—B、乙216．08a56．573．1a63．160．66a43．4826．3la6．953．8生防菌株的鉴定41 3．8．1生防菌株的菌落及菌体特征观察菌株BY-2在NA培养基上28℃培养24h观察，菌株革兰氏染色呈阳性，菌体呈长杆状(图15a)。芽孢染色呈绿色，菌体呈红色，芽孢呈椭圆形近中生(图15b)，BY-2菌株在LB平板上菌落近圆形，边缘整齐，呈乳脂色，不透明，前期表面光滑平整，后期表面褶皱明显且颜色变红(图15c)。Bz．2菌体特征与BY-2特征大致相同区别在于BY-2单菌落前期为圆形，BZ．2单菌落前期边缘有些许皱褶。a：gramS协inmglsvioletb：Sporcstammgf．orgrccnc：Colonlalmo甲hOlogyaRer4轴oIIrsOtcuItIlm图15BY．2的菌体形态和培养菌落特征Figl5Thecolony锄dmicroscopiccharactersofBY_23．8．2菌体的扫描电镜观察结果从(图16)可以看出，BZ．2、BY．2细菌形态均为长杆状，菌体长度1．2um，单生，细菌可产生芽孢，芽孢产生在菌体中部，卵圆形，产芽孢的菌体不膨大；在环境扫描电镜钨灯丝光源下未发现鞭毛。图16．乱BZ一2的扫描电镜观察Fig16．乱ObseⅣationBZ-2byel。c昀nmicroscope3．8．3两株生防菌株的生理生化特性b．BY-2的扫描电镜观察b．obsen，ationBV2byel蝴microscope菌株BY-2、BZ．2的生理生化特性鉴定结果见(表15)。该菌株接触酶反应和V_P反应均呈阳性，苯丙氨酸解氨酶反应阴性。能氧化葡萄糖产酸，能还原硝酸盐和水解淀粉，能在含7％氯化钠的NB培养液中生长，能产生H2S。依据伯42 杰细菌鉴定手册和常见细菌系统鉴定手册，菌株BY．2、BZ一2的形态特征与生理生化特性与枯草芽孢杆菌(曰．s“6疗凰)最为接近。表15两株生防细菌的生理生化特性Tablel5．Physiolo百calandbiochemicalch矧捌厕csoftwo柚tagonistics注：·‘+”：反应呈阳性或者可以生长、利用；‘‘-”：反应呈阴性或者不可以生长、利用。Notc：‘‘+”：positivere∞tion；‘‘．”：negativer龆lion．图17a：淀粉水解Fig17a：Stardlhydmlysisb：明胶液化b：GdatiIlllydr01ySis3．8．4两株细菌的16SrDNA、gyrB序列扩增以菌株BY-2、BZ一2的总基因组DNA为模板，经PCR扩增和电泳检测，分别得到1条大小约1．5kb的特异性条带。这与以往16SrDINA在所有细菌中都高43 度保守且长度恒定(约1．5kb)的报道相吻合。测序结果表明：BY-2、BZ．2扩增的16SrDNA序列长度分别为1541bp、1542bp。对BY-2、BZ．2菌株的gyrB序列进行扩增并测序得其全长均为1259bp，这与以往报道的gyrB基因长度约为(1．2kb)的报道相吻合。∞戆彝——薹露鼗戆——零摹Q——器器0——29臻——重臻鼗——一Ml2图18菌株BY．2、Bz．2的16SrDNA的PCR扩增电泳图谱M：Marker泳道l：BY乏的16SrDNA的PCR扩增片段泳道2：BZ．2的16SrDNA的PCR扩增片段Fig18PCRp砌uctofme16SrDNA矗”mebact耐alsn面nsBY-2狮dBZ-2M：M矧kerLinel：PCRf．orl6SrDNAofs打ainBY．2：Line2：PCRforl6SrI扑JAofs勃ramBZ．2 2000—◆1000_750一500—◆250_100—专M12图19转化子PCR鉴定Fig19PCRideIltificationofme1’msfonnati∞M：MarkerLiIle1：PCR矗"16SrDNAofs昀inBY-2；Line2：PCR矗w16SrDNAofsn面nBZ一22000专1000专750专500啼250专100专M12图20菌株BY之、BZ_2的gyrBPCR扩增电泳图谱M：Markcr泳道l：BY-．2的gyrBPCR扩增片段；泳道2：Bz一2的gyrBPcR扩增片段Fig20PCRpI咖ctofmegyrBf．ortlIebacterialsn面nsB、-2锄dBZ·2M：MarkcrLml：PCRforgyrBofs嘶nBY-2；Line2：PCRforgyrBofs仃抽BZ_245 S000300020001000750500250100Ml2图2l转化子PCR鉴定Fig21．PCRid蛐衄cati彻ofmeTr锄s鼬mationM：Marker；Linel：PCRforgyrBofsn面nBY-2；Line2：PCRforgyrBofs打ainBZ．23．8．5两菌株的16SrDNA序列比较及系统发育树分析竺二=暨竺：：三=!!!：!!竺ii：!!!!!!!!竺!三!!!!!!!!!!竺三!!!!!!!!!!!!!!竺!婴!!!!圈AcGcTTTcGcTccTcAGcGTcAGTT^cAGAccAGAGAGTcGccTTcGccAcTGGTG!TccTccAcATcTc曩曩lA^TTccGGAcAAcGcTTGcc^ccfAcGTATT^ccGcGGcTGcTeGc^cGTAGTT^GccGTGGcTTf跚G●■；矗TTAGGTAccGT：AAGGTAccGcccTATTcG^^cGGTAcTTGTTcTTcccTAAcAAcAGAGctTTAi五i寻i■—砸TTAGGTAccGTcAAGGTAccGcccTATTcGAAcGGTAcT?etTcTTcccTAAcAAcAGAGcTTTAcGATc矗翻cGAA^AccTTcATcA：TcAcGcGscGTTGcTccGTcAGAcTTTcGTccATTGcGGAAG^TTcciiiiiii日●■圈cGAAAAccTTcATcAOTcAcGcGGcGTTGc!ccGTcAGAcTTTcGTccATTGcGGAAGATTcccTAcTcr●—●圄圈TGccTcccGTAGGAGTcTGGGccGTGTcTcAGTcccAG?GTGGccGATcAcccTcTcA西三i石五五三亍ii石i■_盈TGccTcccGTAGGAGTcTGGGccGTGTcTcAGToccAGTGTGGccGATcAcccTcTcAGGTr洲ⅢGr■曩蜀图22两株生防细菌的16srD№序列比较结果Fig．22111e吲np耐ng姗ltof16SrDNAsequ∞cesfortwos砌ns 从(图22)可以看出菌株BY-2和BZ一2的16SrDNA序列长度分别为1541bp和1542bp，序列中共有6个碱基不同，其中BY-2缺失一个碱基，其序列中的不同碱基用黑框表示。在NCBI中可以检索到12种芽孢杆菌属内与BY-2、Bz．2菌株16SrDNA序列符合率最高的菌株，用PAuP4．O软件分析并进一步构建系统发育树，见(图23)。鼬醐腑础嘲熔(DQl．．70472'眦8博viif脚湘晴Im加帕幻I铆潲(NR舛2638)踟鼬emmBS_7-2《JN(10：垮为)B．s“翻％括毒ub8pmaq埘筠=0脚(HE582781)鼬醐惝sp．(DQ引67∞)8’黜啪№叫bsp。纠喇瓶(GU伯190；4’8萌醐№sp．《AB'∞212)&啪麟s(GU'453'5)矗s“蛹黏(A羽1鸲98)BZ泣8s油l|：|iS(DQ401073l图23基于16SrDNA序列BLAsT结果构建的细菌BV2的系统发育树Fig23Phylogenetic廿eeof12曰dcf跏s仃aillsb觞edonBLAsTreSultsof16srDNASequ肌ce对菌株BY．2、BZ．2与相关细菌的16SrDNA序列进行遗传距离计算，并用PAUP4．0软件分析得到系统发育树(图23)，菌株BY-2与B口cf刀淞属的细菌处于一个大的分支内，从系统发育树可以看出BY-2与B．s“6行凰(DQ470472)的亲缘关系最近，处于同一大分支内，BZ．2与B．s“6砒溶(DQ401073)的亲缘关系最近，处于同一个小分支内，且进化上的距离较近。结合形态学和生理生化性状，同源性及系统发育分析，鉴定菌株BY-2、BZ．2为芽孢杆菌属(肋cf跏)，但不能确定BY．2、Bz．2是枯草芽孢杆菌(B．s”6玎凰)。3．8．6两菌株的gyrB序列比较及系统发育树分析以菌株BY．2、Bz．2菌株的总DNA为模板，PCR扩增出长度约1．2kb的DNA片段，将测定的DNA序列在NCBI网站上，进行最大同源性比较分析，结果表明gyrB的部分序列与B．s“6打凰(DQ309316)、B．s甜6打凰(DQ309314)菌株相应序列的同源性为99％。从(图24)可以看出菌株BY-2和BZ．2的gyrB序列长度均为1259bp，序列中共有12个碱基不同，其序列中的不同碱基用黑框表示。利用NCBI中可以检索到的24株与BY-2、BZ一2菌株gyrB序列符合率最高的菌株，用PAUP4．0软件进一步构建系统发育树，见(图25)。47 1霉7娃盏鼋0l碡匀12蠹9毫翟59图24两株生防细菌的gyrB序列比较结果Fig．24111ecomparingrcsultofgyrBscquencesfor铆ostrains以gyrB基因序列比对结果构建系统发育树(图25)，利用gyrB基因也可以准确鉴定菌株BY_2为曰．s“6打凰，并能获得BY-2与己知种的亲缘关系，构建系统发育树的结果表明，BZ．2与B．s幻ff船(EU729128)、曰．s“6行凰(DQ309316)、曰．s“6玎胁(DQ309314)的亲缘关系最近处于同一分支内，BY．2与曰．s“6玎胁(EU729128)、B．s“6打凰(DQ309316)、曰．s“6玎凰(DQ309314)处于同一大分支内，结合菌落形态特征、生理生化特性、16SrDNA、gyrB系统发育分析，BY-2、BZ．2菌株均被鉴定为枯草芽孢杆菌B．s拍巧凰。由于枯草芽孢杆菌组已测定gyrB基因的菌株较多，因而gyrB基因也能反应菌株BY_2、BZ一2与其它菌株间的亲缘关系。‘；ll褪l：I幢谨瞳堙《吨嘛．}!；I心《幢《c；II谨‘；．吐瞳《Il：{I心《《《《瞳瞳咄心l：!l幄娩吨瞳戤取群戢群酝戡取滕默班职戤艇嚣舵璐配默弛嚣懿舣聪嚣款搬聪射酩懿戢舣龇醛聪 图25基于24株生防菌株的gyrB序列构建的系统进化树Fig．25．Phylog朗etic仃eesof24肋c硼必s打aillsbased伽舒rBg∞escqu∞ccs3．9枯草芽孢杆菌BY-2的生物学特性研究3．9．1温度对BY_2菌株生长的影响培养温度对菌株BY2的生长和繁殖有明显的影响(图26)在温度为15．45℃范围内，随着温度从15℃上升30℃，BY-2菌株生长和繁殖速率呈上升趋势。随着温度下降至45℃，BY-2的生长和繁殖速率呈下降趋势。所以，菌株BY-2的生长和繁殖最适温度为30℃。1．61．41．2o1暑0．8吕0．60．40．20l52024283032374045培养温度(℃)图26温度对菌株BY-2生长的影响F。lg26Eflectofs咖nBY。2growtllonte唧enlnlre3．9．2PH值对BY_2菌株生长的影响pH值对菌株BY-2的生长和繁殖有明显的影响(图27)，在初始pH值为4—7．范围内，随着pH值的变大菌株的生长和繁殖呈上升趋势。在7．10范围内随着pH值的继续上升，菌株的生长和繁殖速率下降。所以，菌株BY-2的生长和繁殖的最适pH值为7，最低pH值为4，最高pH为10。49 44．555．566．577．588．599．510PH图27DH值对菌株BY-2生长的影响Fig27E腩ctofpHvaLueongrowmandmuLtipLicationofmesⅡ面nBY-23．9．3培养时间对菌株BY-2生长的影响菌株BY-2在接种后48h内处于对数生长期，接种后48．96h处于稳定生长期，此阶段菌量最多，接种96h后进入衰老期，此阶段细菌大量死亡。48r2961￡OE寸间：h)图28培养时间对菌株BY-2生长的影响Fig28Efrectofcultllretimeontllegmwcllofs竹ainBY二23．9．4接种量对菌株BY-2生长的影响菌株最适接种量的筛选，以2％的接种量较适宜，菌种接种量过大，可以使发酵周期缩短，但由于原料消耗快，并不利于细菌的生长和产物合成，接种量过小，细胞量不足而且细胞内部的某些维生素和辅酶等微量元素会向周围液体发生过多的扩散，降低这些物质在细胞内部的浓度，也会降低细胞的活性。5062186201l10oo心口o21R620LnQno。心口。 C)口∞口o21．50．5122．53接种里(％)图29接种量对菌株BY-2生长的影响Fig29E虢ctofInocuhlmsizeonmegrowmofs仃ainBY．251 4讨论4．1大豆疫病的防治措施选用抗病品种是防治大豆疫病的有效途径，也是综合防治的关键措施。但是大豆对疫病抗性高的资源非常少。长期以来，防治大豆疫病主要依靠甲霜灵，品种单一，多次使用造成农业成本增加，部分地区的病原菌对其产生了抗药性，大量使用化学农药造成环境污染加剧及害虫抗药性增加。生物防治一般应用特异性的、能杀死或者干扰特定目标病原物的拮抗微生物来防治病虫害，不仅维护了生态平衡，而且对环境安全、无污染、无抗性，有些生防菌还具有促进植物生长的作用，保证了人畜安全，有效避免了采用化学防治方法所带来的许多弊端。拮抗微生物在病害治理方面的巨大潜力很早就得到了研究者的关注，如苏联在20世纪就开始应用固氮菌提高农作物产量【961。七十年代初，Kerr等[971在澳大利亚利用放射土壤杆菌(彳胛施c纪力“m阳加6口c册K84)成功防治植物根癌病(彳g加6口c纪一“mm，，{屈c把瑚)。芽孢杆菌作为一种有潜力的有效拮抗细菌，是目前研究最为普遍的拮抗细菌之一，有些已经进入实际应用阶段【981，产生了相当的经济和社会效益，并且己取得了令人瞩目的成就。4．2大豆疫病生防菌株的筛选植物的周围、体表以及体内存在着大量微生物，他们与植物一起形成了一种特定的生态系统，其中存在许多有益的拮抗细菌，对许多植物病害具有很好的生防作用眇J。植物病原菌生防因子的筛选在国内备受人们的重视，生防菌的筛选，毫无疑问都需进行大量的初筛工作。目前在生防菌株的筛选中，主要筛选方法为室内平板筛选，离体组织初测防效。复筛中常用温室和大田试验筛选定殖力强或具有促生作用的菌株，本试验从所采集的分离材料中共分离出有较好拮抗效果的菌株4株，同时对实验室保存的菌株粉红单端孢、枯草芽孢杆菌BS、哈茨木霉菌株TH．1进行了拮抗效果的测定，结果表明菌株BY．2表现了很好的的生防潜力，所以本实验重点对BY．2菌株进行了拮抗效果的测定，并对其进行了形态学，分子系统学鉴定。4．3BY．2菌株对大豆疫病的抑菌作用本研究利用分离自大豆疫病田土壤的生防菌株BY-2进行主要研究，室内研究结果表明菌株的平板对峙培养，代谢产物能明显抑制疫霉菌丝的生长，且代谢产物对疫霉游动孢子的萌发也有很强的抑制效果，在研究中发现BY-2菌株产生52 的挥发性物质能显著抑制疫霉菌丝的生长，细菌能够在土壤中迅速繁殖，产生的挥发性代谢产物分子量低，在外界环境(包括水、土壤气孔)中易于传播和扩散，这些结果暗示并支持了细菌挥发物在植物土传病害防治上的潜在应用价值。进一步对其进行了盆栽试验测定，结果表明菌株BY-2对大豆疫霉根腐病有较好的防治效果，当然温室实验与室内环境存在较大差异，活体生防菌在不同环境条件下防效存在很大的不稳定性，如陈志谊等研究的Bs．916菌株对水稻纹枯病的防效在35．1％到80．1％之间，在不同地区、不同年度间颇不稳定【100'101】，有些在离体条件下拮抗力强的菌株在田间条件下对病害不一定产生很好的防治效果，对此需作进一步的筛选。郭坚华等【l02】在筛选防治辣椒青枯病的拮抗细菌中提出了抑菌圈一定殖力双重筛选的方法：Sid等【103】在筛选防治辣椒疫病的拮抗菌时则采用离体叶片的方法；Raikumar等【104】也采用离体叶片法筛选防治辣椒疫病的拮抗菌，并发现离体测定中有些高拮抗力的菌株在离体叶片测定时则效果差，而幼苗测定法在筛选获得有效的拮抗菌上较离体叶片测定法快速且更准确。本试验中BY-2在离体条件下对大豆疫霉的抑制力很强，在盆栽试验中对病害的防治效果一般，由此看见在离体条件下对疫霉有很好防效的拮抗菌在盆栽条件下，效果并不一定是最好。4．4生防菌株BY．2、BZ．2的鉴定细菌的鉴定经历了漫长的研究阶段，传统上细菌的鉴定主要依靠培养性状和生理生化等特征进行分类鉴定，尽管这些表型特征对物种的识别和归类起到了积极和重要的作用，但他们难以表现微生物之间的进化关系，更难以按照生物系统发育相关性水平来对微生物的基因型特征进行探讨和分类鉴定。近几十年来，随着分子生物学的迅速发展，特别是1986年Mullis发明PCR技术以来，细菌的分类鉴定开始进入了分子水平，各种基因型分类方法也应运而生【105】。目前，已经有一整套比较系统的分子鉴定方法，如(G+C)含量，DNA分子杂交、rI斟A指纹图、质粒图谱和16SrDNA序列分析等【1061。本研究综合利用形态观察特征及16SrDNA、gyrB作序列分析对拮抗细菌BY-2、Bz一2进行鉴定，通过NCBI提供的相似序列进行BLaSt比对，绘制进化树，最终鉴定BY-2、BZ．2菌株为枯草芽孢杆菌(Raci|hls孓1lbtiti．s、)n4．5生防菌株BY．2、BZ一2的生防机制枯草芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质，其中以肽类抗菌物质研究的较多，如伊枯草菌素(～类小分子环脂肽类物质)、生物表面活性素等‘1071。蛋白及肽类抗菌物质，可通过硫酸铵盐析后，从菌体培养液中分离得到。其中肽类抗菌物质对53 热稳定，对部分蛋白酶不敏感，经紫外线照射、有机溶剂处理后，均比蛋白类抗菌物质具有更强的抗菌稳定性【lo引，在下一步工作中，可以采用色谱等方法，进一步分离纯化BY-2菌株的活性物质，期望得到一定纯度的拮抗物质，并进一步研究该活性物质的结构及理化性质。进一步，采用基因工程手段获取拮抗菌BY-2的生防基因，研究该生防基因的特征，为探索提高生防能力提供方法与途径，下一步打算用酸沉淀、甲醇抽提和反相HPLC的方法将BY_2发酵液中的脂肽类抗生素分离出来，对其抑菌机理进行研究。54 5结论本学位论文在大豆疫霉拮抗微生物筛选的基础上，对2株拮抗效果较好的细菌菌株BY-2、BZ．2进行了鉴定，并对其离体及活体拮抗作用以及促生长作用进行了研究，得到以下结果：l、采用平板对峙法和杯碟法分别对本实验室保存的哈茨木霉(历幽D如朋口』ll口，Z缸Mm)TH．1菌株及枯草芽孢杆菌(B口cf刀淞s“6疗凰)BS菌株以及6株粉红单端孢(刚砌D砌ecf“聊Me材，，z)菌株进行了平板抑菌作用及代谢产物活性测定，结果表明，它们对大豆疫霉的拮抗效果均不显著。2、从安徽省大豆疫病田采集的大豆根际土壤中分离得到4株大豆疫霉拮抗细菌，平板对峙试验显示，其中拮抗细菌菌株BY-2和BZ一2对大豆疫霉的平板抑制效果分别为79．O％和63．97％。对菌株BY-2、BZ．2进行了鉴定。经形态观察、生理生化特性测定、扫描电镜观察及16SrDNA、gyrB序列分析，鉴定上述两菌株均为枯草芽孢杆菌(召口cf，船s”6疗凰)。3、测定了不同时间的BY-2代谢液对大豆疫霉的抑制活性，结果显示，72h代谢液对供试病原菌的菌丝生长抑制效果最好；BY-272h代谢液对供试病原菌AHl9的抑制效果显著高于其他各菌株，抑制效果达到40．93％。BY-2菌株72h代谢滤液能显著抑制游动孢子萌发，培养滤液处理24h后孢子萌发抑制率为57．71％，且4h后孢子萌发抑制率显著高于其他各处理。4、采用培养皿对扣法，测定了BY-2菌株挥发物对大豆疫霉的抑制活性。结果表明，BY-2挥发物处理对供试大豆疫霉菌株的菌丝生长均有显著的抑制作用，但抑制率随菌株和处理时间不同而有显著差异，其中对菌株AHl9处理第7d时的抑制率最高，为91．94％。5、对筛选获得的生防菌株进行了盆栽试验测定，结果显示菌株BY-2提前3d浸根接种对大豆疫病的防效显著高于各处理，接种10d后调查，防效为75．01％；BY-2菌液处理同时还可显著地促进大豆幼苗的生长；处理的鲜重干重都显著地高于对照，分别增加了63．16％、43．48％，根长和茎长也都显著高于对照，分别比对照增加56．57％、6．95％。6、研究了温度、pH、接种量和培养时间对菌株BY-2的影响，结果表明，菌株Bv2最适生长温度为30℃，最适pH为7．0，最适接种量为2％，最适培养时间为48h，为下一步生防菌剂的开发提供依据。 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致谢本研究从试验方案的设计到论文的撰写都是在我的导师高智谋教授的悉心指导下完成的。在三年的学习期间，得到了导师无微不至的关怀和照顾，在学习和生活中点滴的进步都凝聚着导师的心血。导师渊博的学识，敏锐的思维，严谨的治学态度，兢兢业业、一丝不苟的工作情怀，乐观、宽容、豁达的性格以及不断创新、锐意进取的精神深深地影响着我、教育着我、指引着我、鼓舞着我，从导师身上我学到了很多丰富的知识和做人的道理。在此特向我敬爱的导师表示衷心的感谢和崇高的敬意!感谢安徽农业大学植物保护学院植物病理学教研室各位老师对论文的完成给予的热情帮助和大力支持。在此我要特别感谢植保学院檀根甲教授、丁克坚教授、江彤副教授、吴慧平副教授、陈方新副教授、潘月敏副教授、张立新副教授、陈莉副教授、伍万荣高级实验师、齐永霞副教授，丁婷副教授、郭敏副教授、张华健博士、在实验过程中给我提出了宝贵建议和无私帮助!我还要感谢在实验过程中给予我帮助的许大风、李萍、李秀丽、赵伟、汪涛、代玉立、曹舜、江涛、张汝洋、高宁馨、陈艳芬、母玉翠、李毛毛、蒋冰心、喻海峰、李宁、高飞、吴群、许旭等同学的帮助在此一并致谢。此外，我要特别感谢我的父母对我的教导和培养，是他们的理解、支持、鼓励和企盼给予我奋力进取的勇气、信心和动力；同时感谢我的老师与亲友们对我的支持和鼓励，正是他们在我攻读学位过程中给予我多方面的支持和帮助，使得本论文能够顺利完成。最后向参加论文评审、答辩并给予指导的各位专家、教授表示衷心的感谢和美好的祝福163杨光红2012年6月于安徽农业大学 个人简介杨光红，女，汉族，中共预备党员。1985年8月出生，山东寿光人。2009年9月考入安徽农业大学研究生学院植物病理学专业，师从高智谋教授，主要从事真菌学及植物真菌病害研究。在读期间，先后参加高智谋教授主持的农业行业科研专项、安徽省自然科学基金科研项目、发表论文3篇。攻读硕士学位期间已发表的学术论文[1]杨光红，高智谋，曹舜，江涛，汪涛．大豆疫病拮抗菌株的筛选及生防作用．安徽农业大学学报．2012[2】李萍，戚仁德，杨光红，许周典．辣椒疫霉交配型及其与对辣椒致病力的关系初步研究．安徽农业大学学报，2011，38(3)：319—322．[3】曹舜，高智谋，杨光红等．哈茨木霉TH．1对大豆疫霉和油菜菌核病菌的抑制作用及其机制，中国植物病理学会2010年学术年会论文集，北京：中国农业科学技术出版社，2010，732—733．