地西他滨对小鼠淋巴瘤细胞免疫原性的增强作用及机制探索

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1、南开大学硕士学位论文地西他滨对小鼠淋巴瘤细胞免疫原性的增强作用及机制探索姓名：梅振阳申请学位级别：硕士专业：临床医学指导教师：于力；王立新2012-05摘要摘要地西他滨(Decitabine，DAC)作为一种新型去甲基化药物，主要用于骨髓异常增生综合征(MyelodysplasticSyndrome，MDS)及急性髓系白血病(AcuteMyeloidLeukemia，AML)的治疗。研究发现DAC可以上调许多免疫相关的分子，增强肿瘤细胞的免疫原性，在白血病患者的治疗中发现，去甲基化药物可以诱导产生肿瘤特异性细胞毒性T细胞(CytotoxicLymphoctye，CTL)，

2、人们推测去甲基化药物具有增强抗肿瘤免疫反应的作用。我们选取小鼠T淋巴瘤／淋巴细胞白血病细胞EL4，建立小鼠淋巴瘤模型，研究DAC对EL4细胞免疫原性的增强作用并对其机制进行探索。1．地西他滨诱导小鼠淋巴瘤细胞EL4凋亡我们用不同浓度的DAC体外处理EL4细胞，通过CCK．8法检测细胞的增殖情况，发现DAC对EL4细胞的生长抑制作用具有浓度依赖性，0．259M时，有30％的增殖抑制作用。此时，细胞形态发生了明显变化，呈现出一种不典型的凋亡状态，且在体内成瘤性也明显下降。经过Amaexin．V／PI双染后，流式检测发现DAC浓度越高，细胞凋亡越明显，且以早期凋亡为主。2．地西

3、他滨上调CD80分子基因表达谱芯片筛查结果显示，DAC处理后EL4细胞肿瘤相关抗原和CD分子(ClusterofDifferentiation)的表达都上调了，其中CD80表达的上调很明显。我们利用PCR技术和流式细胞仪检测，证实DAC上调EL4细胞CD80在mRNA和蛋白水平的表达，上调状态在体外能够持续30天左右。同时我们发现DAC体内治疗也能够上调EL4细胞CD80的表达量。通过对EL4细胞CD80启动子区甲基化测序，我们发现CD80的表达跟DNA甲基化关系密切。3．地西他滨上调OD80强化抗肿瘤免疫反应在动物实验中，我们发现DAC能够抑制EL4细胞的成瘤性。通过流

4、式细胞I摘要仪检测发现，DAC治疗后肿瘤内T细胞侵润明显增多。胞内细胞因子染色结果表明：T细胞IL．2和IFN．Y的分泌量也明显增加。利用抗．CD8和抗．CD4单克隆抗体建立淋巴瘤小鼠CD8+T细胞或CD4+T体内清除模型，发现DAC治疗后CD8+T参与了抗肿瘤反应。混合淋巴细胞培养发现DAC处理后的EL4细胞能够有效刺激淋巴细胞增殖，刺激T细胞分泌IL．2和IFN．Y，当CD80被阻断后，其对淋巴细胞的刺激能力下降。通过流式分选技术从DAC处理后的EL4细胞中分选出CD80+和CD80一细胞群，对小鼠进行接种，发现CD80+组小鼠肿瘤生长明显缓慢，且部分肿瘤会停止生长并

5、缩小，流式分析结果发现CD80+组肿瘤中T细胞和NK细胞的侵润都显著高于CD80。组，说明DAC诱导CD80上调，增强肿瘤免疫原性，强化了抗肿瘤免疫反应。综上，我们的研究发现DAC可以诱导EL4细胞表达多种免疫相关分子，增强其免疫原性，其中CD80起重要的作用，并首次发现CD80表达跟DNA甲基化的关系，丰富了免疫调节受表观调控的内容，为去甲基化药物增强免疫治疗效果提供了新的理论依据和方法。关键词：地西他滨，去甲基化，CD80，免疫原性，抗肿瘤免疫反应AbstractDecitabine(DAC)，asonekindofnovelhypomethylatingagent，

6、1Smainlyusedforthetreatmentofmyelodysplasticsyndrome(MDS)andacutemyeloidleukemiafAML)．IthasbeenprovedbyrecentstudiesthatDACcanup’regulatemanylmmuneassociatedmolecules，andenhancetheimmunogenicityoftumor．Clinically,hypomethylatingagentcaninducecytotoxiclymphocyte(CTL)，whichindicatesthathypo

7、methylatingagentispotentialtoimprovetheanti-tumorimmuneresponse·ⅥksetuplymphomamicemodetostudythemechanismandeffectivenessofDACinenehancingimmunogenicityoftumorofEL4cellline．1。ApoptosisofEL4cellsinducedbyDecitabineWetestedtheDroliferationofEL4cellsaftertreatmentofDA