sirna沉默cdc2的表达对骨肉瘤mg63增殖及凋亡的影响

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1、分类号R6密级公开UDC硕士学位论文siRNA沉默Cdc2的表达对骨肉瘤MG63增殖及凋亡的影响学位申请人：阙祥勇学科专业：外科学指导教师：李新志副教授二○一二年五月ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineEffectsofSiRNA-mediatedCdc2silenceontheproloferationandapoptosisofMG63cellsGraduateSt

2、udent:QueXiangyongMajor:SurgerySupervisor:Prof.LinXinZhiChinaThreeGorgesUniversityYichang,443002,P.R.ChinaMay,2012三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意

3、识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名，日期，三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认，我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺，我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文

4、作者签名，日期，I三峡大学硕士学位论文内容摘要目的：Cdc2基因所编码的蛋白是一种重要的细胞周期蛋白,在包括骨肉瘤MG63细胞的大多数肿瘤细胞中呈高表达。在本研究中采用siRNA干扰技术，抑制骨肉瘤MG63细胞中Cdc2基因的表达，观察Cdc2基因表达抑制后对MG63细胞增殖及凋亡的影响。方法：构建针对Cdc2基因表达的特异性siRNA表达质粒psilencer2.1-U6/Cdc2及对照psilencer2.1-U6/scramble质粒，通过脂质体介导稳定转染入人骨肉瘤MG63细胞株，通过Westernb

5、lotting和定量PCR检测MG63细胞中Cdc2在蛋白和mRNA水平的表达情况，免疫荧光进一步检测细胞形态变化和Cdc2表达的情况，MTT法和流式细胞术检测psilencer2.1-U6/Cdc2对MG63细胞增殖能力和细胞周期的影响，Westernblotting检测细胞凋亡蛋白Bcl-2,Bax的表达情况。结果：（1）经重组质粒DNA经测序鉴定，成功构建了pSilencer2.1/SiRNA重组质粒（2）将所构建的pSilencer2.1/SiRNA重组质粒分别转染骨肉瘤MG63细胞,hygromyc

6、in筛选阳性细胞克隆，经Westernblotting和RT-PCR法检测结果表明，成功获得稳定转染psilencer2.1-U6/Cdc2质粒的MG63细胞（MG63-SiRNA/Cdc2），和阴性对照细胞(MG63-SiRNA/Scramble),并通过灰度分析发现，MG63-SiRNA/Cdc2细胞中Cdc2mRNA和蛋白表达与MG63-SiRNA/Scramble细胞相比沉默效率分别为86%和89%。（3）MTT法检测发现干扰Cdc2的表达可以抑制MG63细胞的增殖，流式细胞术检测细胞主要易聚积于G2

7、/M期,G0/G1期，同时S期细胞减少。Westernblotting检测发现，干扰Cdc2基因的表达对MG63细胞中的凋亡蛋白Bcl-2,Bax的表达影响不大。结论：Cdc2基因可能参与了肿瘤的发生过程，并与肿瘤的增殖有关，通过SiRNA干扰Cdc2的表达能抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖，但对其凋亡的影响不大。关键词：骨肉瘤MG63SiRNACdc2细胞增殖凋亡II三峡大学硕士学位论文AbstractObjective:Cdc2isakeyoftheeukaryoticcelldivisioncyclegen

8、e,codingforserine/threonineproteinkinase,ishighexpressioninosteosarcomaMG63cells,andotherhumorcells.Inthisstudy,weinterferetheCdc2expressioninosteosarcomaMG63cellsbysiRNAtechelonogy,andthenobservethepr