人胚胎干细胞向胰岛素阳性细胞诱导分化体系优化论文

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1、原创性声明本人声I{月，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究j』：_：=作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文·}14≮包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得·f_l肖火学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我．t1：Ml：作的I司志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：丝盔盔日期：丝年丛月旦日学位论文版权使用授权书本人J7解tl一南人学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文)i：根据皤家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被惫阅和f龄阅；学校呵以公布

2、学位论文的全部或部分内容，nJ’以采用复印、缩印或其它亍．段保存学位论文。

3、司时授权中困科学技术信息研究所将本学位论文收录到《t”}．I困学位论文全文数据库》，并通过列络向社会公众提供信息服务。擎．——广人胚胎千细胞向胰岛素阳性细胞诱导分化体系的优化摘要第一章人胚胎干细胞(hESCs)向胰腺内分泌前体细胞诱导分化的比较目的：通过比较文献中已报道的效率较高的诱导方案，找到在本实验室条件下获得胰腺内分泌前体细胞的最佳诱导方案。方法：体外诱导hESCs需要依次经历限定性内胚层、胰腺内分泌前体最终才会成为胰岛素阳性细胞，这是体内p细胞发育分化过程的重演。利用本实

4、验室已经建立好的条件，将人胚胎干细胞诱导至限定性内胚层阶段。然后分三组分别用D’Amour、HongkuiDeng、Hosoya实验室报道的诱导方案将细胞往胰腺内分泌前体诱导。在诱导的第10天以及第13天收集样本，用免疫荧光、间标流式、real．timePCR等检测手段比较三种诱导方案获得胰腺内分泌前体细胞的效率。结果：仅Hosoya小分子方案组在第10天至第13天的过程中PDXl+细胞的比例出现明显的上调；D’Amour组呈现显著下降趋势；HongkuiDeng组呈现基本持平状态。仅Hosoya小分子方案组在第10天至第13天能持续检测到较多的NGN3

5、+细胞；D’Amour组呈现下降趋势，且NGN3+细胞比例很低；HongkuiDeng组几乎检测不到NGN3+细胞。结论：仅Hosoya小分子方案能更好的将限定性内胚层细胞诱导为胰腺内分泌前体细胞(PDXl+&NGN3+)。第二章人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性(Ins+)细胞诱导分化的研究目的：比较基础培养基：D／F一12、高糖．DMEM；成熟因子方案与Hosoya的小分子方案获得胰岛素阳性细胞的效率。方法：利用第一章所得到的优势方案(小分子诱导方案)，将hESCs诱导至胰腺内分泌前体起始阶段，即诱导的第10天。然后将细胞分为两大组，其

6、中一组用成熟因子方案诱导，另一组继续用IIHosoya实验室报道的小分子方案诱导；分别考察两种诱导方案下，基础培养基中不同葡萄糖浓度在诱导第18天获得Ins+细胞的差异。用免疫荧光、间标流式、real—timePCR等检测手段比较各方案获得Ins+细胞的效率。结果：高糖．DMEM加成熟因子组在诱导的第18天获得Ins十细胞的效率最高，达27．43％+2．97％。D／F．12加成熟因子组、高糖一DMEM加小分子组和D／F．12加小分子组的Ins+细胞比例都不及21％。而追溯到诱导的第13天检测成熟因子5fid,分子组在表达胰腺内分泌前体阶段标记基因显示成熟

7、因子组PDXl、NGN3、Beta2基因的mRNA的相对表达量是小分子组的数倍结论：培养基中葡萄糖浓度对终末形成Ins+细胞效率在成熟因子组中高糖能促使p细胞增殖，低糖能使细胞内Ins含量增加；而在小分子组中无区别。在获得Ins+细胞效率上高糖．DMEM加成熟因子比小分子方案有优势，其原因可能并不是胰腺内分泌前体阶段，PDXl+&NGN3+细胞数量的多少，而与其PDXl和NGN3表达量有关。推测PDXl、NGN3的表达可能存在一个阈值是激活其下游基因启动所必须的。第三章帚二早人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性细胞诱导方案的优化目的：以高糖．

8、DMEM加成熟因子诱导方案为基础优化人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性细胞诱导方案方法：利用第一章所得到的优势方案(小分子诱导方案)，将hESCs诱导至胰腺内分泌前体起始阶段，即诱导的第10天。以第二章中高糖．DMEM加成熟因子诱导方案为基础进行分组，将成熟因子Betacellulin、Exendin．4、IGF．1进行自由组合，分为无因子组、单因子组、双因子组、三因子组。将细胞诱导至第18天，用免疫荧光、间标流式、real—timePCR等检测手段比较各方案获得Ins+细胞的效率。结果：在诱导第18天获得Ins+细胞比例最高的三组分别为双

9、因子组中的Exendin一4&IGF一1、单因子组中的Exendin一4及IGF