基于比色酶片与金标免疫层析试纸的食品安全快速检测技术研究

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1、浙江大学硕士学位论文基于比色酶片与金标免疫层析试纸的食品安全快速检测技术研究姓名：张雪吟申请学位级别：硕士专业：农业电气化与自动化指导教师：郭希山2012-04浙江大学硕士学位论文摘要近年来食品安全重大事件层出不断，人们对于国内的食品安全普遍持怀疑态度，如何度过这场“信任危机”是我国食品行业急待解决的问题。现有食品质量监督体系普遍建立在实验室仪器分析技术的基础上，食品的抽样送检过程，不仅耗时费力，且信息发布严重滞后，很难对消费者质疑的产品进行快速反应。同时，由于对监管体制的不信任，越来越多的消费者期望能自

2、己对产品进行快速定性检测，尤其是对每日生活所必需的农副产品。因此，迫切需要发展快速、灵敏、低成本的食品安全现场快测技术。本研究针对食品安全中的农药残留和渔药残留问题，分别研制了比色酶片和金标免疫层析试纸。基于有机磷与氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制作用，以吲哚酚乙酸酯为酶促水解反应的显色底物，制备了一种抛弃型比色酶片用于农药残留快速检测。在选择了合适的酶源与显色底物后，通过比较不同载体及不同固定方法对于制备酶片性能的影响，最终确定采用物理吸附法将AChE固定到HybondN+膜上。经过对酶

3、固定过程中的温度、时间、干燥方法及点样酶量的优化，以酶活回收率为指标，确定了酶片制备的具体过程为：将5止AChE稀释液(800U／mL)点样到1cm2的HybondN+膜中央，4℃下固定30min后用PBS(0．1mol／L，pH8．0)冲洗数次，再将酶片真空冷冻干燥并保存于4℃冰箱中，该方法制各的酶片酶活回收率可达27．3％。此外，通过对检测过程中底物浓度、抑制时间和显色时间的优化，确定了最终的检测过程为：取50此待测样品液滴加至酶片上，30℃下抑制15min后，用吸水纸吸去多余样品液，滴加10吐的吲哚

4、乙酸酯溶液(10mmol／L)，10min后观察显色结果。该酶片显色结果为蓝绿色，通过比较显色强度的变化，酶片对农药标样氧乐果、毒死蜱、敌敌畏、甲胺磷、甲奈威与抗蚜威的检出限分别为1、0．1、2、0．05、1．5与0．8p马／mL。将研制的酶片用于果汁(葡萄汁、苹果汁和橙汁)与生菜样品的检测结果证实，该酶片具有灵敏度高、准确度高、重现性好等优点，可用于农产品中有机磷与氨基甲酸酯类农药残留的快速检测。基于胶体金免疫层析技术，采用竞争法，以硝酸纤维素(NC)膜为载体，以兔抗氯霉素多克隆抗体为标记蛋白，制备了一

5、种金标免疫层析试纸条用于渔药残留快速检测。该检测系统选用20nm直径的胶体金用于标记抗体，最适pH为8．0，最适蛋白结合量为每1mL胶体金结合7．2“g抗体蛋白。标记成功的金标抗体经低温高速离心法纯化后，以1：5比例稀释并取20此固定到用PBS(0．01mol／L，pH8．0，10％蔗糖，0．05％吐温一20)预处理过的玻纤膜上，作为金标垫。用于包被NC膜的抗原与二抗浓度分别为1mg／mL和0．5mg／mL，各取1此点样到NC膜上，再用浓度为1％的BSA进行封闭处理。对氯霉素标准水溶液的测试结果显示，本研

6、究制各的试纸条检出限为1．5ng／mL，整个测试时间约为10min，重现性良好，且置于4℃环境下保存90d后仍稳定可靠，为水产品中氯霉素渔药残留的快速检测提供了一条可行途径。关键词：食品安全快速检测，农药残留，渔药残留，酶抑制法，免疫层析浙江大学硕士学位论文AbstractInrecentyears，duetothefrequentlyreportedfoodsafetyevents，peoplearegenerallyskepticalofthefoodsafety．Howtosolvethe”trus

7、tcrisis”isabigproblemtobesolvedbythepeopleengagedinfoodprofession．Theexistingfoodqualitysupervisionsystemisgenerallybasedontheinstrumentanalysistechnology,whichistime-consumingandhigh—costing，andwilldelaytheactualreleaseofinformationforthefoodsafetydeterm

8、ination．SoitCannotprovidetherapidresponsetotheconsumerqueries．AttheSalTletime，duetothedistrustindomesticfoodregulatorysystem，moreandmoreconsumersexpecttoconductthedeterminationoffoodsafetybythemselves，especiallythef