经典的wnt信号通路在大鼠肝脏卵圆细胞增殖和分化中的作用

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1、·４３２４·中华临床医师杂志（电子版）２０１１年８月第５卷第１５期ＣｈｉｎＪＣｌｉｎｉｃｉａｎｓ（ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＥｄｉｔｉｏｎ），Ａｕｇｕｓｔ１，２０１１，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．１５·论著·经典的Ｗｎｔ信号通路在大鼠肝脏卵圆细胞增殖和分化中的作用张影綦盛麟程宁张勇【摘要】　目的探讨激活经典的Ｗｎｔ信号转导通路在大鼠肝脏卵圆细胞增殖、分化中的作用。方法不同浓度的重组Ｗｎｔ３ａ纯化蛋白（２０，４０，８０，１６０，２００ｎｇ／ｍｌ）在无血清培养条件下作用ＷＢ唱Ｆ３４４细胞２４ｈ，Ｂｒｄｕ掺入法检测细

2、胞增殖情况。１６０ｎｇ／ｍｌ重组Ｗｎｔ３ａ纯化蛋白在无血清条件下作用ＷＢ唱Ｆ３４４细胞，作用２４ｈ后通过免疫荧光观察β唱ｃａｔｅｎｉｎ亚细胞定位的变化，Ｗｅｓｔｅｒｎ唱ｂｌｏｔ观察β唱ｃａｔｅｎｉｎ蛋白表达的变化；半定量ＲＴ唱ＰＣＲ观察下游靶基因ＣｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡ表达的变化。作用７２ｈ后通过ＲＴ唱ＰＣＲ观察ＣＫ唱１９，ＡＦＰ，ＡＬＢ，ＨＮＦ唱６，ＨＮＦ唱４αｍＲＮＡ表达的变化，Ｗｅｓｔｅｒｎ唱ｂｌｏｔ观察ＣＫ唱１９，ＡＦＰ蛋白表达的变化。以同期未做处理的ＷＢ唱Ｆ３４４细胞作为空白对照。结果

3、不同浓度的重组Ｗｎｔ３ａ纯化蛋白作用后，处理组ＷＢ唱Ｆ３４４细胞以剂量依赖方式增殖，Ｗｎｔ３ａ处理组明显高于空白对照组（P＜０畅０５），１６０ｎｇ／ｍｌ作用时，增殖达到最高峰。Ｗｎｔ３ａ（１６０ｎｇ／ｍｌ）作用２４ｈ后，通过免疫荧光共聚焦观察β唱ｃａｔｅｎｉｎ的亚细胞定位发现，处理组β唱ｃａｔｅｎｉｎ在ＷＢ唱Ｆ３４４主要在细胞核中表达；而未处理组主要在核周表达；Ｗｅｓｔｅｒｎ唱ｂｌｏｔ发现处理组β唱ｃａｔｅｎｉｎ蛋白表达轻度增加；半定量ＲＴ唱ＰＣＲ发现下游靶基因ＣｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡ的表达显著

4、增加（P＜０畅０１）。７２ｈ后，ＲＴ唱ＰＣＲ发现两组中均有ＡＦＰ，ＣＫ唱１９，ＨＮＦ唱６，ＨＮＦ唱４α基因表达，而ＡＬＢ在两组中均不表达；同时通过Ｗｅｓｔｅｒｎ唱ｂｌｏｔ发现ＡＦＰ，ＣＫ唱１９蛋白在两组中均有表达。结论激活经典的Ｗｎｔ信号转导通路促进大鼠肝脏卵圆细胞系ＷＢ唱Ｆ３４４的增殖和自我更新。【关键词】　经典的Ｗｎｔ信号通路；　卵圆细胞；　增殖；　自我更新TheroleofcanonicalWntsignalingpathwayintheproliferationanddifferenti

5、ationofrathepaticovalcellZHANGYing，QISheng唱lin，CHENGNing，ZHANGYong．TheFirstDepartmentofLiverDisease，DalianSixthPeople′sHospital，Dalian116031，ChinaCorrespondingauthor：ZHANGYing，Email：zy730302＠yahoo．com．cn【Abstract】　ObjectiveＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆｃａｎｏｎ

6、ｉｃａｌＷｎｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｏｖａｌｃｅｌｌｓinvitro．MethodsＷＢ唱Ｆ３４４ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＷｎｔ３ａ（２０，４０，８０，１６０，２００ｎｇ／ｍｌ）ｉｎｔｈｅｓｅｒｕｍ唱ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓ．ＣｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＢｒｄｕｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ，ｕｎ唱ｔ

7、ｒｅａｔｅｄＷＢ唱Ｆ３４４ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔａｋｅｎａｓｃｏｎｔｒｏｌ．ＡｆｔｅｒｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＷｎｔ３ａ（１６０ｎｇ／ｍｌ）ｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓ，ｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆβ唱ｃａｔｅｎｉｎｉｎＷＢ唱Ｆ３４４ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄＷｅｓｔｅｒｎ唱ｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ．ＣｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂ

8、ｙｓｅｍｉ唱ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ唱ＰＣＲ．ＴｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆｓｏｍｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｍａｒｋｅｒｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＡＦＰ，ＣＫ唱１９，ＡＬＢａｎｄｔｗｏｈｅｐａｔｉｃｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｓ（ＨＮＦ唱４α，ＨＮＦ唱６）ｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＲＴ唱ＰＣＲ．ＣＫ唱１９ａｎｄＡＦＰｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎ唱ｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ．ResultsＷｅｆｏｕｎｄｔｈａｔＷｎｔ３ａｐｒｏｍｏｔｅｄｐｒｏｌｉｆｅｒ