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1、第21卷第2期环境化学Vol.21,No.22002年3月ENVIRONMENTALCHEMISTRYMarch2002植物酶抑制技术用于检测蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留钟树明袁东星金晓英许鹏翔(厦门大学环境科学研究中心,海洋环境科学教育部重点实验室,厦门,361005)摘要应用植物酶抑制技术检测蔬菜中的有机磷及氨基甲酸酯类农药.用小柱对样品进行预处理,可去除叶绿素的干扰、提高检测灵敏度.提出了抑制率阈值(15%).应用本方法对市售蔬菜的农药残留进行了调查,检出率约为10%.关键词:蔬菜,有机磷农药,氨基甲酸酯类农药,植物酶,抑制率.利用有机磷
2、农药对乙酰胆碱酯酶的特异抑制作用发展的酶化学比色分析法,已广泛[1,2]应用于痕量和微量有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的检测,但是乙酰胆碱酯酶来源于动物体,材料昂贵,且保存困难.近年来发展了用植物水解酶替代乙酰胆碱酯酶的分[3]析方法,该法利用植物水解酶水解26二氯乙酰靛酚,根据反应溶液在水解前后颜色的变化,用眼睛或仪器辨别农药对酶的抑制程度.在有机磷或氨基甲酸酯类农药存在时,植物水解酶的活性受到抑制,靛酚的蓝色变浅.本研究采用小柱净化,能有效去除萃取液中的叶绿素;应用植物酶抑制技术检测蔬菜中的有机磷及氨基甲酸酯类农药;并根据有关标准提出了抑制率阈值.1仪器和试剂BECKMANDU8B
3、紫外可见分光光度计,带恒温装置(美国产),XK95型多用振荡器(江苏新康仪器厂),LD42离心机(北京医用离心机厂).[4]26二氯乙酰靛酚指示剂:取01mol干燥的26二氯靛酚钠盐(德国产,上海试剂有限公司进口分装)于锥形瓶中,加入03mol的乙酸酐,在振荡器中振荡2h.在室温下静置1h后加入600g碎冰块,15h后过滤,滤出物用水洗后溶于乙醚中,加无水硫酸钠干燥,在水浴上蒸发至约10ml,然后加入4倍体积的石油醚稀释或加石油醚直到出现结晶为止.过滤,滤液冰冻冷却后得晶体,再用乙醚/石油醚重结晶一次.真空干燥.晶体避光保存.称取所得晶体10mg,溶于10ml14二
4、氧六环(分析纯,上海试剂三厂)-1中,即得10mgml的26二氯乙酰靛酚指示剂,避光保存.-1-1磷酸盐缓冲液(01moll):混合947ml01moll磷酸氢二钠溶液和53ml-101moll磷酸二氢钠溶液,得pH值为80的磷酸盐缓冲液.[5]面粉酶溶液:称取5g市售面粉于锥形瓶中,加入20ml蒸馏水,在振荡器上振荡-130min,以20003000rmin在离心机上离心10min,上清液用针筒式过滤器过滤,得面190环境化学21卷粉酶溶液,置于4冰箱中保存.50%甲胺磷乳油(福建省三农公司),50%辛硫磷乳油(江苏省
5、城市利民化工厂),增效甲基异柳磷乳油(青岛双收农药公司),80%敌敌畏乳油(江苏梅兰公司),氧化乐果乳油(中国人民解放军第九七一五工厂),175%增效水胺硫磷乳油(湖北省仙桃市农药厂),40%乐果乳油(沈阳新城化工公司),敌百虫原粉(南宁化学工业集团),3%呋喃丹粒剂(南宁化学工业集团).2样品预处理预处理柱:在直径1cm的10ml塑料离心试管下部钻一直径约为2mm的小孔,依次填入少量玻璃纤维和1g硅藻土545(上海试剂有限公司进口分装).取蔬菜菜叶10g,适当剪碎,置于25ml离心管中,加入10ml磷酸盐缓冲液,振荡[3]1min,将液体倒入预处理柱,接收流出液,即为样品溶液.3定性
6、和定量分析定性分析:取两支试管,一支加样品溶液27ml,另一支加磷酸盐缓冲溶液27ml,分别加入02ml植物酶溶液,于40下恒温10min,分别加入01ml26二氯乙酰靛酚指示剂,40下再恒温10min,对比两试管中溶液的颜色.若样品管溶液的蓝色较浅或呈现橙色,说明酶活性受到抑制,样品中含有机磷或氨基甲酸酯类农药.标准工作曲线的绘制:在1cm比色皿中依次加入24ml磷酸盐缓冲液、03ml农药水溶液(使最终浓度分别为0010,0033,0067,010,033,067,10,33,67,-1100,333,1000mgl)、02ml植物酶溶液,在
7、40下恒温10min,于605nm处读取吸光值.然后加入01ml26二氯乙酰靛酚指示剂,40下再恒温10min,于605nm处读取吸光值.用磷酸盐缓冲液替代农药溶液,在同上的操作下,得空白溶液的吸光值,按下式计算抑制百分率.抑制率(%)=(A空白-A样品)A空白100式中,A空白表示显色前后空白溶液的吸光值变化;A样品表示样品的吸光值变化.定量分析:采用外标法.抑制率与样品中有机磷及氨基
