人细胞外基质支架联合bfgf-pla纳米微球缓释系统对人脂肪来源干细胞构建工程化脂肪组织影响的研究

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1、南方医科大学2009级博士学位论文人细胞外基质支架联合bFGF．PLA纳米微球缓释系统对人脂肪来源干细胞构建工程化脂肪组织的影响研究，1‘’’‘‘●1●1●乙0nstrUctengineeredadiposetissueuslngadlDOSe-derlVedstemcellswithhumanextraceUularmatrixscaffoldandbFGF-PLAnanospheresdeliverysystem课题来源：福建省福州市科技计划项目专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员整形外科学察鹏飞高建华教授李世荣教授付小兵教授李青峰教

2、授柳大烈教授罗深秋教授论文评阅人李世荣教授付小兵教授罗深秋教授2012年5月3日广州博士学位论文人细胞外基质支架联合bFGF．PLA纳米微球缓释系统对人脂肪来源干细胞构建工程化脂肪组织的影响研究博士研究生：察鹏飞指导教师：高建华摘要研究背景目前，脂肪组织工程技术理论的发展，为真正实现无损伤修复软组织缺损和真正意义上的形态、结构与功能重建开辟了新的途径。但仍有很多因素制约着脂肪组织工程技术的发展。其中没有合适的细胞支架材料及生物学活性的细胞因子是制约其发展的重要因素。合适的生物支架材料是组织工程学中一个非常重要的组成部分，它不仅是细胞和生物活性因子进入机体的

3、载体，而且还可以支持细胞在体内的增殖和分化及分泌活性细胞因子。理想的脂肪组织工程支架应具有：①适于细胞粘附、增殖和分化的三维空间结构；②具有良好的机械力学性能，不仅与宿主软组织特性相匹配，还要能够抵抗软组织的压力支持种子细胞的生长发育；③具备良好组成成分，对组织无毒、无副作用、无免疫原性；④具有特殊的生物刺激作用，如促进细胞的增殖分化，促进血管生成，促进宿主干细胞的迁移和分化等。但是，虽然目前对于支架材料的应用研究很多，但每种支架材料都有自身的局限性，所以至今仍无适合于脂肪组织工程的理想支架材料。关于脂肪组织工程支架材料的选用还在不断摸索当中。细胞外基质(

4、ExtracellularMatrix，ECM)是存在于细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖。ECM中含有大量的细胞活性成分，从而对细胞的粘附、增殖、迁移、分化和基因表摘要达的调控发挥着重要的调节作用。脂肪组织当中不仅含有大量的细胞成分，而且还含有丰富的ECM成分，包括胶原、网状纤维、弹性纤维、神经纤维、血管基质和淋巴结。从脂肪组织当中提取细胞外基质并构建成支架理论上完全具有可行性，国内还未见相关报道。碱性成纤维细胞生长因子(Basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)因具有明显促进脂肪来源干细胞(Adipose

5、．derivedstemcells，ADSCs)和骨髓基质干细胞的血管化、迁移和成脂分化的作用，在脂肪组织工程研究领域是一种比较理想的细胞因子。但是，bFGF在体内应用时扩散快、对热和酸非常敏感、易被蛋白酶分解、半衰期仅为3-～5min，严重限制了其生物学效应的发挥。药剂学的缓释技术很好的解决这一难题，它通过微球包埋技术将bFGF包埋于聚乳酸纳米微球中，从而使这种细胞因子能够缓慢的释放，达到对周围环境持续发挥生物学效应的目的。这种缓释技术在脂肪组织工程的研究领域具有很大的研究价值。研究目的1．从人脂肪组织当中分离提取ADSCs，并进行多向诱导分化，探讨其干

6、细胞特性及作为脂肪组织工程理想种子细胞的优势；2．体外构建bFGF聚乳酸纳米微球缓释系统(bFGF．PLA．NS)，检测体外缓释能力；并检测这种缓释微球体外对ADSCs增殖和成脂分化能力的影响，探讨其应用于脂肪组织工程研究的可行性；3．体外收集人脂肪组织，并分离提取细胞外基质，将其制备成粉末状，分析其结构特点，探讨其作为脂肪组织工程支架材料的可行性；4．体P[-DiI荧光标记ADSCs并将ADSCs与细胞外基质支架进行粘附，分析ADSCs与细胞外基质支架的生物相容性，探究这种细胞外基质支架材料能否应用于体内研究实验；5．通过设计合理对照，将细胞外基质支架联

7、合bFGF．PLA缓释微球及ADSCs移植于裸鼠体内，探讨细胞外基质支架联合bFGF．PLA缓释微球对ADSCs构建工程化脂肪组织的影响。材料与方法II博士学位论文1．ADSCs的体外分离培养及多向诱导分化鉴定收集抽脂术患者的脂肪组织，纯化后用I型胶原酶消化、过滤、离心、铺皿进行原代培养，观察细胞生长状态。第3代的ADSCs用于实验研究。用MTT法绘制细胞增殖生长曲线；用相应的定向诱导液对ADSCs向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞方向诱导分化，并用油红0、茜素红和阿新蓝染色进行鉴定。2．体外构建bFGF．PLA缓释微球并检测其对ADSCs增殖和成脂分化能力影响

8、体外用超声乳化法构建bFGF．PLA缓释微球，检测微球载药量和包封