冷冻保存小鼠脂肪组织来源的干细胞 祖细胞(翻译)

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1、CellTransplantation,Vol.17,pp.35-41.2008CropreservationofMouseAdiposeTissue-DerivedStem/ProgenitorCells冷冻保存小鼠脂肪组织来源的干细胞/祖细胞（翻译）摘要有报道，脂肪组织来源的干细胞/祖细胞（ASCs）不仅可分化为中胚层细胞，如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，也可分化为内胚层细胞，例如肝细胞、胰岛素分泌细胞。这类干细胞/祖细胞有望用于各种再生治疗。本研究证明用七种冻存液，包括10%DMSO、DMSO细胞冷冻液、甘油细

2、胞冷冻液、CellBanker1、CellBanker1+、CellBanker2和CP-1，冻存得ASC有细胞活性及成脂/成骨分化潜能。ASCs取自小鼠皮下脂肪组织。用CellBanker2冻存的ASCs的细胞活性超过90%，CellBanker1、CellBanker1+或CP-1保存的约有90%活性，10%DMSO、DMSO细胞冷冻液、甘油细胞冷冻液保存ASC活性低于80%。用与没用CellBanker2保存的细胞在成脂/成骨分化潜能上没有区别。数据显示，CellBanker2是ASCs冷冻保存的最有效的解决方

3、法，冻存ASCs及非冻存ASCs都可用于再生医疗。介绍干细胞存在于多种器官，包括骨髓、肝脏、胰脏、脂肪。骨髓间充质干细胞（MSCs）是多潜能细胞，可在体内和体外诱导分化成多种功能的中胚层组织，包括骨、软骨、腱、脂肪以及骨髓基质。数项研究显示MSCs可分化成其他类型的组织特异性细胞，例如骨骼肌、肝脏和中枢神经系统的细胞。中枢神经系统含有可分化成造血干细胞或骨骼肌细胞的干细胞。这些结论提示多潜能MSCs在再生医学组织工学方向上使用广泛。近来，脂肪组织被视作另一个MSCs的来源。因为脂肪组织的MSCs比骨髓来源的MSCs更

4、容易获得，脂肪组织来源的干细胞/祖细胞（ASCs）有望与其他干细胞用于临床研究。ASCs有自我更新的能力，可经诱导分化多种间充质组织，包括软骨细胞，脂肪细胞，肌细胞和内皮细胞。随着冻存细胞技术的进步，冷冻保存对细胞研究者更有意义，其应用包括干细胞运输，收集细胞以达到治疗剂量，安全完成任务节省时间和质控检测。然而，有研究报道冻存对干细胞、祖细胞的不利影响。冻融细胞的最终存活率体现了多种损伤细胞的机制对细胞的综合影响。如果用快速冷却法保存，那么溶液无法维持平衡，因为细胞外溶液的化学势降低的速率远大于水分从细胞中扩散的速率

5、。这种不平衡的最终结果则是可观察到细胞内形成冰晶，这对细胞是致命的。冷却速度是决定冻存干细胞活性的关键因素。在复苏时也存在相似的不利影响。含DMSO或甘油的冷冻保存液可用于解决这种影响。在骨髓移植应用中，多数研究机构冻存骨髓用的是含10%DMSO的冻存液，然后在程序降温仪中以1℃/min的速率冷冻。然而，一些研究指出细胞接触到DMSO会损失一定的祖细胞活性。因此，有必要使用专用的对干细胞、祖细胞无害的冻存液。虽然几项研究报道了冻存干细胞/祖细胞的效果是基于保存时间和冻融速度，但少有研究报道不同冻存液的影响作用。本研究

6、中，7种冻存液经过了一系列测试确定处哪一种冻存小鼠ASCs效果最佳。CellTransplantation,Vol.17,pp.35-41.2008材料和方法【分离和培养小鼠脂肪组织来源的干细胞、祖细胞】1.皮下脂肪组织取自8周龄成年小鼠；2.脂肪组织重0.5g，用Hank’s平衡盐溶液洗三次，切细，用1mlI型胶原酶（1mg/ml）消化，37℃水浴孵育1小时，并来回震荡；3.250μm筛网过滤消化的组织，细胞悬于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基；4.室温下细胞1200rpm离心5分钟，收集的细胞在培养前清洗

7、三次；55.T-25培养瓶添加含20%FBS的DMEM/F12培养基，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，接种1*10个细胞，37℃、5%CO2培养；6.细胞传代3-4代。【小鼠脂肪组织来源干细胞/祖细胞的冻存和细胞活性鉴定】4251.接近长满的时候，细胞密度大约2.5-6.5*10cell/cm，胰酶EDTA消化小鼠ASCs，离心后以2*10cell/ml的密度悬浮于七种冻存液中；2.冻存液有10%DMSO，DMSO细胞冻存液，甘油细胞冻存液，CellBanker1，CellBanker1+，CellBa

8、nker2，CP-1；3.冻存液中的细胞迅速冷却，保存在-80℃7天；4.融化细胞后，迅速用培养基稀释细胞；5.细胞1200rpm离心3分钟，重悬在5ml培养基中；6.细胞活性用台盼蓝染色法测定。【成脂细胞分化鉴定】1.诱导方法：含100μM吲哚美辛（消炎痛）、1μM地塞米松、1μM氢化可的松、10μg/ml胰岛素、10%FBS的DMEM高糖培