tnf-α、il-1β诱导人角质形成细胞β防御素表达的实验研究

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1、．山西医科大学硕士学位论文1-1配制过程DMEM109青霉素100mg链霉素100mgNaHC033．79HEPES2．3831910％胎牛血清100ml加三蒸水定容至1000ml，磁力搅拌致完全溶解，PH值7．0。1．2无菌处理(1)将多个容器为100ml的耐高压瓶、无孔胶塞及滤器高压灭菌处理。(2)在超净工作台中过滤有菌的DMEM培养液。(3)抽滤完毕后，75％酒精擦拭所有容器表面，移入超净工作台，将1000ml无菌DMEM培养液分别装入100ml玻璃瓶中后置．20。C保存待用。(4)取10ml无菌培养液放入37。C，50ml／LC02培养箱中作细菌及霉菌培养，若有菌则全部培养

2、液重新处理或重新配制，若无菌则冰冻保存，使用前放入4。C复温。(5)胎牛血清100ml，进行56。C水域灭活30min，无菌状态下按10％力n入配制好的DMEM培养液中。2．PBS缓冲液：NaCl8．09KCl0．29Na2HP03．12H203．69KH2P030．249加三蒸水定容至1000ml，磁力搅拌致完全溶解，高压灭菌后置．20。C保存待用。四、标本与方法1．细胞培养将Hacat细胞培养于含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，放入37℃，50ml／LC02培养箱中饱和湿度静置培养，每2天换液1次，在细胞生长有重叠时，弃去培养瓶中的培养液，PBS轻轻漂洗后随即传代

3、，用2．5g／L的胰酶消化约2rain，在倒置显微镜下观察细胞间隙变大，细胞变圆，部分细胞脱壁后，加入等量的DMEM(含10％胎牛血清)终止消化，吸管轻轻吹打使贴壁细胞完全脱落，并使其分散，收集含消化液的细胞悬液于10ml离心管中，1000r／min离心3rain，以l：6的比例传代培养。2．实验分组将培养的Hacat细胞分为四组：对照组、n忭吨组、IL—lp组、TNF．Ct+IL．1p组，7．山西医科大学硕士学位论文对照组不加任何药物干预，其余各组分别于6h、18h、24h加入药物后用RT-RCR方法检测hBD一2mRNA的表达。3．TNF-Q、IL-lB干预Hacat细胞将浓度

4、均为40ng／ml的TNF·a、40ng／ml的IL一113、40ng／mlTNF—a+40ng／mllL．1p分别加入相应的培养瓶中与Hacat细胞共培养6小时、18小时、24小时后提取总RNA，实验重复进行3次。4．mRNA表达的检测4．1总RNA的提取：(1)离心后弃培养液上清用PBS反复冲洗后加入lmlTrizol，室温放置5rain，使其充分裂解。(2)12000r／rain离心5min，弃沉淀。(3)按200ul氯仿／mlTrizol加入氯仿，振荡混匀15min，室温放置15min。(4)4"C12000r／rain离心5min。(5)吸取上层水相，至另一离心管中。(6

5、)按O．5异丙醇／mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置10min。(7)4"C12000r／min离心5min，弃上清，RNA沉于管底。(8)按lml75％乙醇／mlTrizol加入75％的乙醇温和振荡离心管，悬浮沉淀，共两次。(9)4"C12000r／min离心5min，尽量弃上清。(10)50ulH20(经DEPC处理并高压)溶解RNA样品，置．20"C保存待用。4．2RNA纯度的测定(1)紫外分光光度仪预热15min。(2)两个3ml石英杯里加入lml无菌三蒸水，调零。(3)加样杯内加入提取的RNA溶液4ul。(4)分别测定260nm、280nm处OD值。(5)RNA纯度

6、=OD260nm／OD280nm，本实验RNA纯度均在1．6．1．8之间，说明样品符合RNA样品纯度要求。’4．3逆转录合成cDNA-(1)在无RNase的新的PCR管中依次加入：MgCl210xR，r-PCRBu虢rdNllPMixtureRNaseInhibitorAMVReverseTranscfiptaseR2ul1ullul0．25ulO．5ul．山西医科大学硕士学位论文Random9实验样品RNA以上共计10ul样品。0．5ul4．75ul(2)以上样品混匀后置PCR仪中按下列条件进行反应：30℃，10mira42℃，30min，99℃，5min；5"C，5min：共三

7、个循环。4．4PCR引物的设计与PCR反应体系、循环参数：HBD．2根据Genebank的hBD．2基因eDNA序列由Primer3软件设计：上游引物：5’ateteetetegtteete3’，下游引物：5'acettetagggcaaaagaet3’预期扩增产物长度126bpGAPDH根据Genebank的GAPDH基因eDNA序列由Primer3软件设计：上游引物：5’ageaeagteeatgccateae3’，下游引物：5’teeacectgttgctgta