山奈酚对小鼠黑色素瘤自杀基因系统的增效作用

《山奈酚对小鼠黑色素瘤自杀基因系统的增效作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、国家自然科学基金项目(81072906)山奈酚对小鼠黑色素瘤自杀基因系统的增效作用学位申请人曾玲导师吴映雅副教授广州中医药大学基础医学院2014年6月广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使

2、用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名监论文导师签名—燧13期：加件年6月2日逾日望肥一名易奎年者h丫作羽姚勿论虬翊期中文摘要目的：建立小鼠黑色素瘤B16细胞HSV卜tkGFP／GCV自杀基因系统，为直观研究中药活性成分山奈酚对该自杀基因系统的增效作用的实验研究打下基础；证实中药活性成分山奈酚对小鼠

3、黑色素瘤B16细胞HSV卜tkGFP／GCV自杀基因系统具有增效作用。方法：1．B16细胞株HSV卜tkGFP／GCV自杀基因系统的建立：首先扩增转有质粒pLXSN—tkGFP的大肠杆菌，用U1traPureQIAGENPlasmidMidiKit抽提质粒；然后参照Lipofectamine2000转染试剂说明书，将重组质粒pLXSN—tkGFP和pLXSN—DsRed2分别转染入小鼠黑色素瘤B16细胞，经过G418筛选、流式分选和有限稀释法，最终获得对G418有抗性并且能自发稳定红绿荧光的单克隆细胞株，分别命名为B16-tk

4、GFP和B16-RFP。用51J．mol／L、50pmol／L和500iJ．mol／LGCV验证B16一tkGFP细胞tk基因的表达。将单克隆细胞株B16一tkGFP(能稳定表达绿色荧光蛋白GFP)和B16一RFP(能稳定表达红色荧光蛋白RFP)按不同比例(20％、40％和60％B16一tkGFP)混合，加GCV处理后采用MTT法检测总细胞的抑制率；另外在荧光显微镜下观察混合细胞中B16一tkGFP细胞和B16一RFP细胞的变化，特别是未携带tk基因的B16-RFP细胞被杀伤的情况，以评价该重组自杀基因系统HSVl一tkGFP

5、／GCV的自杀效应及其旁杀伤效应。2．山奈酚对B16细胞株HSVI-tkGFP／GCV自杀基因系统的体外增效作用：先用MTT法找到山奈酚不影响B16细胞生长的安全浓度和作用时间，再用DiI—Calcein双染料流式检测法分析安全浓度范围内的山奈酚对B16细胞GJIC功能的影响，以以检测绿色荧光细胞数量与荧光双阴性受体细胞比值，作为评价GJ功能的指标。应用MTT法检测山奈酚联合GCV对100％tk+和50％tk+增效的量效关系，并利用金正均Q值法分析和判断山奈酚与HSVI-tkGFP／GCV系统联合的作用效果；荧光显微镜观察山奈

6、酚对HSV卜tkGFP／GCV系统旁杀伤效应的影响。3．山奈酚对小鼠黑色素瘤B16细胞株HSVI-tk／GCV自杀基因系统的体内增效作用：将活化的B16-tkGFP细胞和B16-RFP细胞按等比例混合后接种于C57BL／6J小黑鼠右腋皮下，待出瘤(接种后第8天)后将其随机分为致瘤模型组、GCV50mg／kg组、山奈酚40mg／kg组和山奈酚40mg／kg联合GCV50mg／kg组，每组10只小黑鼠，次日起按各给药组要求每天腹腔注射给药0．2ml／只，联合组的GCV和山奈酚分开给药，连续给药13天；同时致瘤模型组小黑鼠每天相应腹

7、腔注射生理盐水0．2ml／只。在给药期间，每三天量一次肿瘤大小和称一次体重，以观测各组药物对小黑鼠的体重变化和给药后的抑瘤效果(n=10)。实验结束后解剖取出各组肿瘤、胸腺和脾脏，称重后用10％中性甲醛固定备用。各组分别取出部分肿瘤组织制作石蜡切片，HE染色后观察各组肿瘤组织形态变化。结果：1．将提取的质粒pLXSN—tkGFP和质粒pLXSN—RFP分别转染入B16细胞，最终成功筛选出对G418具有抗性的单克隆细胞株B16-tkGFP(能自发稳定的绿色荧光)和单克隆细胞株B16-RFP(能自发稳定的红色荧光)；经GCV杀伤实

8、验证实了转入的tk基因在B16-tkGFP细胞中能正常稳定地表达。B16一tkGFP细胞和B16一RFP细胞的混合细胞共培养实验中，MTT检测结果及荧光显微观察图片表明了该重组自杀基因系统具有一定的旁杀伤效应(P