奶牛乳腺成纤维细胞中tlr、nod及其信号通路相关基因mrna表达检测

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1、万方数据爿DissertationSubmittedtoSichuanAgriculturalUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementforMasterDegreeofScienceExpressionofTLR、NODandrelatedgeneofthesignalingwayinbovinemammaryfibroblastsLiaoChunyingSupervisedbyAssociateprofessorSuizhongCaoYa’an，Sichuan，ChinaJune2014万方数据论文独创性声

2、明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：声渺扭vc肇年钼t-日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、

3、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：厚e嘏导师签名：鸷船弦缈年‘月，明p?仁毛R

4、曲万方数据摘要Toll样受体(Toll-likereceptor，TLR)和核苷酸结合寡聚化结构域蛋白(Nucleotide-bindingoligomerizationdomainprotein，NOD)是存在于细胞膜上或细胞内的模式识别受体，能够识别病原微生物进而启动信号通路，使细胞释放炎症因子，参与先天性免疫反应。成纤维细胞通常是一种不活跃的细胞，在乳腺中主要起到支持乳腺组织结构和修复损伤的作用。但是近年来

5、研究发现，炎症时成纤维细胞受到某些刺激变得活跃，活化的成纤维细胞持续释放炎症因子，使炎症由急性转为慢性。研究成纤维细胞免疫的分子作用机制对乳腺炎的防控可能具有重要意义。本研究检测奶牛乳腺成纤维细胞中TLR和NOD的表达情况，并对细胞中TLR和NOD信号通路进行研究，从而初步揭示乳腺成纤维细胞的在先天性免疫方面的作用，为深入研究奶牛乳腺成纤维细胞免疫学机制提供实验依据。1．奶牛乳腺成纤维细胞的分离培养培养原代奶牛乳腺成纤维细胞采用组织块法。根据成纤维细胞和上皮细胞对胰酶敏感度不同，差时消化法连续纯化成纤维细胞。每天定时观察细胞的形态和生长情况，用纯化的成纤维细胞

6、测生长曲线。吉姆萨染色鉴定细胞形态。结果显示：3～5d开始有成纤维细胞从组织块周围向外游出，7d左右可见上皮细胞爬出组织块。2种细胞不混杂生长，存在着明显的界限。采用差时消化法对细胞进行3—5次纯化，可得到较为纯净的奶牛乳腺成纤维细胞。吉姆萨染色观测细胞形态呈长梭形，边缘光滑，排列疏松，区别于上皮细胞，可确定为奶牛乳腺成纤维细胞。结果表明从乳腺组织中成功分离出奶牛乳腺成纤维细胞。2．奶牛乳腺成纤维细胞TLR训烈A的表达及半定量分析RT．PCR检测脾脏组织中TLRl一TLRl0mRNA表达情况，应用半定量RT．PCR技术分析TLRl～TLRl0基因mRNA在奶牛

7、乳腺成纤维细胞中的表达水平。结果显示TLRl～TLRl0在奶牛脾脏和乳腺成纤维细胞中均表达，其中TLRl、TLR3、TLR4和TLR5相对高表达，而TLR2、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和TLRl0相对低表达(氏O．05)。结果表明奶牛乳腺成纤维细胞中TLRl～TLRl0均有不同程度表达。3．奶牛乳腺成纤维细胞NODmRNA的表达及半定量分析万方数据RT．PCR检测脾脏组织中NODl和NOD2mRNA表达情况，应用半定量RT．PCR技术分析NODl和NOD2基因mRNA在奶牛乳腺成纤维细胞中的表达水平。结果显示，从奶牛脾脏和乳腺成纤维细胞中分别扩增出

8、NODt和NOD2基因的预期条带，NOD2基因mRNA的表达量相对高于NODl(氏O．05)。结果表明奶牛乳腺成纤维细胞中NODl和NOD2均有不同程度表达。4．奶牛乳腺成纤维细胞中TLR和NOD信号通路相关基因及其下游炎症因子mRNA表达检测采用RT．PCR方法检测奶牛乳腺成纤维细胞中MvD88、TRIF、TRAF6、IRAKl、IRAK4和NF．r．B(p65)基因的mRNA表达，其次检测细胞中IL．6、IL．8和TNF一0【的mRNA表达。结果显示，TLR信号通路的接头蛋白MyD88、TRIF、TRAF6、IRAKl和IRAK4，TLR和NOD信号通路的

9、转录因子NF．1(B(p65)以及炎症