多重pcr同步检测mdv、apv和edsv的技术研究

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1、分类号——UDC密级——编号——牟中唯j『鬣火等硕士学位论文多重PCR同步检测MDV，APV和EDⅣ的技术研究学位申请人姓名：壅整璺申请学位学生类别：全堕盥塑±申请学位学科专业：查生垒堑至指导教师姓名：杨继红教授⑨一MASTER⋯'STHE粥硕士学位论文必㈣㈣．,．1,

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6、㈣llllIllY2558629。多重PCR同步检测MDV、APV和EDSV的技术研究论文作者：张栋梁指导教师：杨继红教授学科专业：水生生物学研究方向：病毒分子生物学华中师范大学生科院2014年5月⑧硕士学位论文MASTER’STHESISAnove

7、ltechniqueofsimultaneousdetectingAvianpoxvirus，Marek，Sdiseasevirus，andEggdropsyndromeviruswithMultiplexPCRAThesisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheM．SDegreeinhydrobiologyByDongliangZhangPostgraduateProgramCollegeofLifeSciencesCentralChinaNormalUniversitySup

8、ervisor：JihongYangAcademicTitle：Professors；印⋯塑ApprovedMay，2014⑧硕士学位论文MASTER’STHESIS华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。作者挠猕檠魄加蛑期7日学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解华中师

9、范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后遵守此规定)保密论文注释：本学位论文属于保密，在——年解密后适用本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。作者签名：；椭日期．：wlo-．ff-j月刁日导师签名：奶≮玩日期：％o晰f月zg日本人已经认真阅读“CALIS高校

10、学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文提交“CALIS高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的规定享受相关权益。圄塞途塞握童厦溢卮!旦圭生；旦=玺；旦三生发查!作者签名：富移铂、澡日期：沙lu．-．ff-j月刁日导师张奶徽日期：谢母f月易踮⑧硕士学位论文MASTER’STHESIS摘要家禽养殖在我国具有悠久的历史，随着我国经济快速的发展，养禽业的发展规模与速度与日俱增，而制约其发展的主要难题是禽病，尤其是病毒性疾病。其中APV、MDV和EDSV是三种鸡的B类传染性疾病。通常，用于检测病原体的主要方法有病毒的分离与鉴定、

11、血清学鉴定以及PCR方法等。本文所要研究的多重PCR方法虽与常规PCR原理相同，但可以用于多种病毒的检测，且与常规单一PCR一样灵敏，是一种快速、有效的检测方法，在病毒检测领域具有广泛的应用市场。本研究利用DF．1鸡胚成纤维细胞分别增殖了MDV、APV和EDSV，并利用异硫氰酸胍法提取病毒DNA，然后根据三种DNA序列分别设计了l对特异性引物，并将扩增的片段克隆到pMDl8．T载体中，以此建立了可同时检测三种病毒的多重PCR方法，并优化了多重PCR反应条件，最终确定了多重PCR反应体系为20此：0．2肛LGoTaqFlexiDNApolymer

12、ase(5U／p．L)，4皿5xGoTaqFlexibuffer，0．4p．LdNTP(10raM)，2．41aJ-,MgCh(25raM)，APV·F／R0．40．L，MDV-F／R0．4p．L，EDSV-F／R0．2：止，模板各lttL，灭菌水8．0ttL；反应程序为：94"C，5rain：94℃，30s，54"C，30s，72℃，30s，循环40次；最后72℃，10min。利用优化后的多重PCR方法分别检测了MDV、APV、EDSV以及任意组合，反应结果与预期结果一致，还检测了其他对禽类危害也较大的病毒，如NDV、AIV、j址Ⅳ、IBDV

13、和IBV，均无扩增片段，说明该方法具有较强的特异性。利用构建的阳性克隆质粒，研究了多重PCR检测的灵敏度，多重PCR检测APV的灵敏度为103copi