乙型肝炎病毒hbsag基因稳定转染chang-liver肝细胞系差异表达蛋白研究

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1、军医进修学院博士学位论文本研究拟通过比较蛋白质组学研究策略及平台，进行乙型肝炎病毒HBsAg基因稳定转染Chang．Liver肝细胞系差异表达蛋白的研究，寻找肝细胞中因表面抗原蛋白基因的整合，而出现异常表达的蛋白质分子，分析鉴定，为进一步探明HBV致病(癌)的分子生物学机制提供实验室依据，以期促进抗病毒药物、抗肿瘤治疗方案的发展。蛋白质组学的研究是继基因组研究之后生命科学的最新前沿。蛋白质是生命活动和生物结构最主要实际承担者。蛋白质虽然都是基因编码的，但与基因组相比，具有更强的多样性和可变性，在产生和代谓}方面受到多种因素的调节，因

2、此对蛋白质组的研究可以在更深入、更贴近生命本质的层次上去发现和理解生命活动的规律，以及重要生理、病理现象的本质。蛋白质在疾病中的重要作用使得蛋白质组学在人类疾病的研究中有着极为重要的价值，目前已被广泛应用于各种疾病的研究中。蛋白质组学研究方法是对蛋白质混合物的一种高通量、大规模的分析，易化了对蛋白间相互作用及蛋白结构的研究。而比较蛋白质组学，通过对正常状态和病理状态下组织或细胞中蛋白质表达数量、表达位置和修饰状态的差异比较，发现与这种病理状态或疾病相关的特异蛋白质。二维电泳和质谱分析技术及生物信息学技术、计算机网络技术和相关的图像识

3、别软件的发展，可以1次分析出几百种不同的蛋白产物。利用蛋白质组学对肝脏进行的研究也进展迅速。已分别从肝整体、细胞、细胞器、细胞器的亚单位等进行了蛋白组学研究。本研究拟HBsAg基因序列插入pEGFP．N1质粒的多克隆位点，使其位于EGFP的N端。利用脂质体法转染ChangLiver细胞，用G418选择培养、筛选，获得稳定转染细胞系，稳定表达HBsAg．EGFP融合蛋白。再将稳定表达目的蛋白的ChangLiver—HBsAg—EGFP细胞系及空质粒对照的ChangLiver—EGFP细胞系裂解，进行双向凝胶电泳。应用ImageMast

4、er2DPaltinum5．1软件(Amersham)对胶图进行斑点检测和匹配分析。选取差异蛋白质点，用MALDI—TOF—MS质谱分析，获得肽质量指纹图谱(PMF)，经Mascot搜索查询和生物信息学分析，鉴定差异表达的蛋白质分子，以期5军医进修学院博士学位论文分析HBsAg基因整合至肝细胞基因组后对肝细胞的影响，为探索HBV感染的发病机制提供实验数据和理论依据。6军医进修学院博士学位论文第一部分．帚一郡分乙型肝炎病毒HBsAg真核表达载体的构建材料和方法1材料1．1TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，EcoRI、BamHI限制

5、性内切酶购自美国Promega公司，高保真PCR试剂盒(ExpendHighFidelityPCRSystem)为Roche公司产品。1．2Poly(A)、dNTPs、糖原购自德国BoehringerMannheim(BM)公司，X-gal、IPTG购白美国Promega公司，琼脂糖购自F112ca公司，胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxid公司，购自Invitrogen公司，其它生化试剂为国产分析纯试剂。1．3DNA凝胶回收纯化试剂盒(QIAQ12ickGelExtractionKit)，质粒大量提取及纯化试剂盒(MaxiPlasmid

6、ExtractKit)均为德[国QIAgen公司产品。斑口0109∞56】I(13e0)11加口‘I)412)ECFPGCC^cC^TeCTc图卜1pEGFP—N1质粒及多克隆位点图1．4pEGFP—N1载体由人民医院张璐博士提供，(如图1-1)。质粒．7．军医进修学院博士学位论文ploxp／HbsAg(Ampr，12kb，含2．2kb插入片段HBV—S(HBVadr一1)由军事医学科学院生物工程研究所发育和疾病遗传学研究室提供。1．5PCR引物合成及测序由北京博亚公主要仪器和耗材。1．6高速低温离心机CFl5R为HITACHI公司

7、产品，台式高速离心机Micromax为德国IEC公司产品，PTC-100PeltierThermalCyclerPC仪为美国MJResearch公司产品，凝胶自动成像系统GELDoc2000为Bio-Rad公司产品，恒温气浴摇床为哈尔滨东明医疗仪器厂产品。2pEGFP—N1一S质粒的构建方法：2．1PCR弓[物：序列特异性引物由上海博亚生物技术有限公司合成，50d，各分装两管，每管用DEPC水200“1溶解振荡混匀，数小时后一20℃冻存。(加入纯水体积p1)：OD×33×106／M1jy／50(引物浓度：终浓度50pmol／“1)S

8、ensePrimer：5’一CCggaattccgaacatggagaaca一3’(EcoRl)AntisensePrimer：5’一cgcggatcccgaatgtatacccaa一3’(BamHI)2．2HBV-S基因的PCR扩增