伯氏疟原虫酸性钙体的分离纯化及其蛋白质组学研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文伯氏疟原虫酸性钙体的分离纯化及其蛋白质组学研究Isolation，purificationandproteomicsresearchoftheacidocaIcisomesinPIasmodiumberghei课题来源：国家自然科学基金(31170147)学位申请人程莎莎导师姓名郝文波教授专业名称免疫学培养类型学术型培养层次硕士研究生所在学院生物技术学院2014年5月27日广州硕士学位论文伯氏疟原虫酸性钙体的分离纯化及其蛋白质组学研究硕士研究生：程莎莎指导教师：郝文波、罗树红摘要研究背景及目的：疟疾仍是严重危害人类健康

2、的‘超级杀手’，这种传染病每年夺去大约100万人的性命，导致4亿人感染。在热带和亚热带地区，疟疾是常见疾病也是严重的公共卫生问题，统计数字显示，每年全球有几亿人感染疟疾，虽然大多数患者能够治愈，可是仍有一百万人死亡，其中以儿童占了多数【I'21。世界卫生组织对疟疾给予密切的关注，遏制疟疾已成为全球奋斗的目标。我国也提出到20】5年大部分地区消除疟疾，到2020年全国实现消除疟疾的目标【3】。有效的药物是治疗疟疾的主要方法。然而，疟原虫对抗疟药耐药性和蚊虫对杀虫剂的抗药性己成为实现全球疟疾控制所面临的最主要威胁。以青蒿素为基础的联合疗法(ACT)是目前治

3、疗恶性疟疾这一最致命的疾病形式最强有力的武器，其疗效能达到90％以上，但在柬埔寨和泰国边境地区近期已确认出现青蒿素耐药性【4-51。鉴于目前医学界使用的所有治疗疟疾药物都出现耐药性现象，因此开发抗疟疾新药不但至关重要而且面临着急迫性。寻找有效的药物作用靶标是研制抗疟新药的基础。寄生虫为了适应不同的外界环境和宿主环境，在长期进化过程中，其体内许多特殊的细胞器被保留下来，而这类细胞器在宿主体内不存在，是寄生虫特有的。因此，通过对这些细摘要胞器的结构和功能的深入研究，就有可能发现针对这些寄生虫的特异靶标。近期研究发现并命名的一个新细胞器一酸性钙体(Acido

4、calcisome，Ac)就是其中之一。酸性钙体一种近期发现的细胞器，大量研究表明其参与了寄生虫的生长代谢、侵袭宿主、产生毒力等过程‘6Jo)，是一种潜在的抗疟靶点。酸性钙体是由美国伊利诺依大学Dr．Doc姗poRoben0教授的研究团队首先在锥虫体内发现并命名【Il，121。随后又在利什曼原虫【13】，顶复门原虫：弓形虫∽171、疟原虫【18—2们、艾美原虫‘2¨，绿藻口21、霉菌【23】、细副24，251及人类血小板口61中均发现有该类细胞器的存在。该细胞器与过去报道的“颗粒”(granmes)相似，其共同特点是内含大量钙和多聚磷酸盐。虽然这些“颗

5、粒”早在1904年就有文献报道【271，但直到最近二十年才对其结构和功能进行了系统研究，并命名为酸性钙体口3’301。许多具有酸性钙体的寄生原虫或细菌，皆为致病病原体，而酸性钙体的特点在于其焦磷酸酶(pyrophoSphataSe)活性，由于哺乳类细胞缺乏此酶，如果能针对此酶研发药物以阻断其活性，便有可能杀死具有此类胞器的致病病原体[31’321。因此，开展对酸性钙体的深入研究具有重要应用价值。对酸性钙体的研究中，以锥虫和弓形虫的研究最为深入。研究发现，酸性钙体的膜上有许多泵：如钙泵(Ca2+一ArPaLse)、质子泵(、，acuol小H+一ATPas

6、e，V如uol孙H+一pryophosphatase)、钠／氢泵(Na+／H+exchanger)、钙／氢泵(Ca2+／H+exchallger)和水蛋白通道(Aquap嘶n)、离子通道等【30l。这些成分对寄生虫的毒性、代谢和入侵宿主具有非常重要的作用。‘目前对疟原虫酸性钙体研究的诸多热点领域如起源与进化、与其它相似细胞器的关系多种酶的基因序列比对及系统发生关系等方面，都需要以蛋白质组学数据提供理论基础，因此，对酸性钙体进行蛋白质组学研究意义重大。疟原虫f18。201中也己证实有酸性钙体的存在，但对其研究远不如锥虫和弓形虫深入，其具体的结构、生物学功

7、能和代谢特点尚未十分清楚。由于恶性疟原虫在体外培养存在一些问题：新鲜血液来源受限，寄生虫在体外培养生长状态不稳定，难以扩大繁殖等，这些问题限制了恶性疟原虫的研究运用。而啮齿类寄生虫伯氏疟原虫与恶性疟原虫在形态结构、基因组成、生理特点、生长周期II硕士学位论文等方面非常相似，因此，本研究把伯氏疟原虫作为研究疟疾酸性钙体的生物模型。研究方法与结果：首先将伯氏疟原虫腹腔注射昆明小鼠内使其大量繁殖，待小鼠发病后摘眼球采血取虫。利用60％的percoll分离液分离得到感染大滋养体和裂殖体的红细胞，皂素裂解红细胞，反复洗涤得到较纯的伯氏疟原虫疟原虫。虫体经碳化硅机

8、械研磨后充分裂解，用bu能rA反复清洗以排除大量疟色素对实验的干扰。接着根据大量文献报道及反复