蛋白质的分离、纯化

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1、第六章蛋白质的分离、纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质蛋白质中的功能团末端α－NH2末端α－COOH侧链基团所以，蛋白质的化学物理性质＝AAA．蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用。B．蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团。C．结合蛋白质辅基成分包含可解离蛋白质D．末端α-COOH,α-NH2E．蛋白质分子中可解离基团的pK'和游离AA中相应基团的pK'值完全不相同。∵在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响F．蛋白质可看作一个多价离子蛋白质等电点--在某一pH值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零。这一pH称为蛋白质等电点等离子点--没有其

2、他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团界离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称等离子点。特征常数。二．蛋白质分子的大小与形状㈥．利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量㈥．利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率这样造成两个后果：　①SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极移动。　②改变了蛋白质单体分子的构象。SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径

3、均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。电泳迁移率μ与多肽链分子量的对数有下列关系(七)毛细管电泳测定蛋白质的分子质量毛细管电泳（CE）则可以在很大程度上克服常规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可以用积分仪或电脑联机精确定量。(八)质谱测定蛋白质分子量质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新技术，其分辨率和精确度都较前几项技术高。尤其近几年发展起来的磁质谱可精确测定分子质量2000Da以下的多肽；而电喷雾质谱（ESI）可以测5万Da的蛋白质，而且只需要皮摩尔（pmol）量的蛋白

4、质，精确度为0.01%。三．蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀1．蛋白质的胶体性质蛋白质溶液是分散系统：分散相是蛋白质分子颗粒，分散介质是水。分散程度-------胶体系统分散相质点--------真溶液（质点是分子，均相系统）分散程度--以分散相质点的直径来衡量根据分散程度：分散相质点在胶体系统中保持稳定需三个条件：a．分散相质点1-100nmb．分散相质点带有同种电荷，互相排斥不聚成颗粒而沉淀c．分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层蛋白质：a.胶体质点的范围c．丁达尔效应d．布朗运动e．不能透过半透膜2．蛋白质的沉淀沉淀蛋白质的方法：①盐析法：中性盐

5、（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→蛋白质脱去水化层优点：不引起蛋白质变性②有机溶剂沉淀法：极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）－→脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用条件：低温操作缩短时间③重金属盐沉淀法当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀用途：抢救误服重金属盐的病人④生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂－－能引起生物碱沉淀的一类试剂当溶液pH

6、体液中干扰测定的蛋白质⑤加热变性测定法原因：a．加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层b．蛋白质处于等电点破坏了带电状态。用途：制豆腐（加热+少量盐卤）四蛋白质分离提纯的一般原则蛋白质提纯的总目标--增加制品纯度或比活性、几增加单位蛋白质质量中所要蛋白质的含量或生物活性。①前处理：材料获得：（一）天然材料：新鲜，含量丰富，易于提取，价格便宜。e.g.钙调素：动物的脑组织，植物花粉胰蛋白酶抑制剂：大豆种子溶菌酶：鸡蛋清抗体：血清（二）基因工程产物：对于天然不易得到的蛋白，通过工程菌或工程细胞表达而获得。②粗分离蛋白质混合提取液

7、∣∣盐析法、等电沉淀、有机溶剂↓所要蛋白质与其他杂蛋白质分开特点：简便、处理量大、既能除去大量杂，又能浓缩蛋白质溶液。粗分离（一）破细胞动物，植物细胞：匀浆，研磨大肠杆菌：冻融，超声，溶菌酶（二）抽提1.pH：选择合适pH的缓冲液，如Tris，磷酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐缓冲体系，保证待分离蛋白在此pH条件下稳定。一般缓冲液浓度为20－50mM。2.温度：低温如4－10℃，蛋白酶活性较低。3.离子强度：如0.1－0.2MNaCl或KCl.4.其他成分：还原剂如NaHSO4，维生素C；巯基保护剂DTT，巯基乙醇；金属螯合剂EDT

8、A，EGTA；蛋白酶抑制剂PMSF。（三）初步分离1.分离细胞器：离心，超离心2.除核酸：酶法DNase,RNase；超声