单细胞凝胶电泳研究进展

《单细胞凝胶电泳研究进展》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、单细胞凝胶电泳研究进展单细胞凝胶电泳(singlecellgelelectrophoresis,SCGE)又称彗星试验(cometassay),是由Ostling建立经Singh等改进的一种检测有核细胞DNA损伤的技术。其原理是：包埋在琼脂糖凝胶中的细胞经裂解和解螺旋，使断裂的DNA碎片进入凝胶，在电场作用下，带负电荷的DNA断片向阳极迁移，形成彗星影像。由于该方法具有敏感、简便、快速、低耗等优点，广泛应用于遗传毒理、环境监测、临床、饮食以及氧化应激和细胞凋亡的研究。随着SCGE技术的发展，其检测损伤的精确性在不断提高。用单纯的SCGE技术所看到的彗星图像，只能辨别其

2、DNA损伤程度，但无法确定DNA断片是从哪条染色体上断裂下来的，于是，SCGE与荧光原位杂交相结合，解决了这一问题。为了进一步了解DNA碱基氧化损伤的情况，在SCGE过程中加入纯化的修复酶来识别损伤的卩密噪和卩票吟，扩大了SCGE的检测范围。本文就彗星试验结合荧光原位杂交、检测DNA碱基氧化损伤、以及在染色、玻片储存和彗星图像分析方面的进展综述如下。1原理及发展在Rydberg等⑴首次定量DNA链断裂后，Ostling等⑵提出了微量电泳技术即单细胞凝胶电泳试验(SCGE)或称彗星试验。该技术是在中性电泳条件下检测DNA双链断裂。随后Singh等⑶将实验条件改为碱性(p

3、H>13),使之不仅能检测DNA单、双链断裂，而且能检测碱性易变性位点(一些只在碱性条件下才转变成单链断裂的DNA损伤)。在碱性条件下，DNA双链解螺旋且碱变性为单链，DNA断链和碱易变性断片从严密的超螺旋结构中释放出来。由于单链断裂的碎片分子量小，屯泳时带负电的断链或碎片离开核DNA向阳极迁移形成“彗星”影像。细胞DNA受损愈严重，产生的断链和碱性易变性断片就愈多，断链或断片愈小，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度，可定量测定单个细胞DNA的损伤程度。彗星试验经进一步改进可用来检测DNA-DNA/DNA-蛋白质交联，由于DNA与DNA分子或D

4、NA与核蛋口的交互联结，在电泳过程中交联剂的存在将使DNA移动困难其至减少。另外，用损伤特异性核酸内切酶消化类核(nucleoids)中的DNA,能将特异的DNA损伤转换成链断裂，如用核酸内切酶III检测氧化的卩密噪，用甲酰胺基卩密噪糖基化酶(FPG)检测改变的卩票吟，进一步提高了彗星试验的敏感性和特异性。在用DNA结合荧光染料染色后，用荧光显微镜能够观察到彗星。尾部的荧光强度反映了DNA断裂的程度，从用目镜测微尺直接观察到用计算机图像分析系统来评价，彗星的分析过程越来越简便。分析软件提供了一系列评价参数，如总长、尾长、DNA在尾部的百分比、尾矩(尾长XDNA在尾部的

5、百分比)、Olive尾矩等，能更好地定量DNA损伤。2实验方法2.1细胞来源及处理：从理论上讲，SCGE可用来检测任何真核细胞的DNA损伤。Kleinsasser等⑷用SCGE分析了人外周血淋巴细胞与上消化道黏膜细胞对遗传毒性物质的敏感性比较，Eastham等⑸用成纤维细胞进行了该项实验，药物对睾丸细胞和精子的DNA损伤作用也曾用SCGE进行综合分析⑹。此外表皮细胞、肿瘤细胞及实验动物的实质脏器细胞都可作为靶细胞。细胞来自培养的细胞或从活体组织分离的细胞。Singh等⑺提出在玻片上或直接制成细胞悬液，加入受试物孵育一段时间后去除受试物，检测DNA损伤⑻；另外，观察处理

6、后培养不同时间的“彗星”以研究DNA的修复情况⑼。体内实验时可以给动物以不同途径染毒，间隔一段时间或取不同时间段分离组织细胞进行SCGE分析。2.2制胶：以无钙、镁磷酸缓冲盐溶液(PBS)配制0.5%正常熔点凝胶和低熔点凝胶，加热熔化后，备用制胶。第一层胶的制备：在毛玻片上滴加110/uL0.5%正常溶点凝胶，加盖盖玻片。此层的目的是促进含细胞的胶层与玻片附着。4°C固化10min。第二层胶的制备：以PBS将受试细胞配成1X10*〜1X108个/L细胞悬液，取50UL(约IX104个细)按1:3的比例与0.5%低熔点凝胶混合。待第一层胶凝固(平整，有光泽)后揭去盖片，

7、滴加75/,L0.5低熔点凝胶与细胞悬液混合液，加盖盖玻片，4C固化10min；第三层胶的制备：揭去盖玻片再滴加110/UL不含细胞的0.5%低熔点凝胶，同样加盖，4°C固化10min。2.3裂解：去掉盖玻片，将凝胶片浸入冰冷的裂解液中(含2.5mol/LNaC1,100mmo1/LN^EDTA,10mmol/LTris,1%肌氨酸钠，10%DMSO,l%Tritonx-100),4°C裂解1h,使细胞裂解，DNA松散。2.4电泳：裂解后取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH=13的电泳缓冲液(含1mmol/LN^EDTA,30