单细胞凝胶电泳.doc

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1、单细胞凝胶电泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首创的,以后经Singh等(1988)进一步完善而逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法,因其细胞电泳形状颇似慧星,又称慧星试验(cometassay)。原理：该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，在DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其他生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其他成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，惟独核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果

2、细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大而停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。若细胞受损，在碱性电泳液（pH>13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核DNA损伤愈重，产生的断链或碱易变性片段就愈多，其断链或短片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。SCGE是评价遗传毒性损害非常敏感的实验,可以检测到每1.657×10-37kg中

3、0.1个DNA的断裂。所需试剂：1）PBS2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）3）0.6%低熔点凝胶（PBS配制）4）毛玻璃片5）盖玻片6）碱性裂解液（2.5mol/LNaCl;100mmol/LNa2EDTA;10mmol/LTris;1%肌氨酸钠），临用前加10%DNMSO，1%TritonX-1007）电泳缓冲液（1mmol/LNa2EDTA;300mmol/LNaOH；Tris-HCl，pH7.5）8）EB（2ug/ml）单细胞凝胶电泳步骤1、分离制备单细胞悬液：（1）体外培养的细胞株：用胰酶消化，最后用PBS悬浮吹打成单细胞悬液，细胞要计数，具体的量我前边已经说过。

4、（2）体内脏器细胞：处死动物，取出脏器，于Hanks’液中制备成单个细胞悬液。2、胶板制备：（1）取100μl于45℃水浴中保温的0.5%NMA，铺于磨沙载玻片上，形成底胶。盖玻片推匀，不能有气泡，4度凝固5至8分钟。（2）水平取下盖片，取100μl于37℃水浴中保温的0.5%LMA与20μl细胞悬液（约400个细胞）混匀，立即铺片，加上盖玻片，4度凝固5至8分钟。3、细胞裂解与电泳：（1）将制备好的胶板去掉盖玻片后，浸于4℃预冷的细胞裂解液中，在4℃下裂解2.5到3小时。（2）取出胶板，用双蒸水浸没漂洗后放入电泳槽中，浸泡在4℃预冷的电泳液中解旋20分钟。（3）玻片水平放置阳

5、极端附近，4℃电泳20到25分钟（25V，300mA）。可在电泳槽周围加冰块以保持低温。4、中和与染色：（1）电泳结束，将胶板浸泡于中和液中，每次10分钟，共中和3次，每次要更换中和液。最后晾干。（2）取出胶板，置于染色缸中，在2μg/ml的EB染色液中，暗处染色5到10分钟。（3）蒸馏水漂洗2次，每次5分钟。稍晾干，滤纸吸去多余水分，尽快在荧光显微镜下观察。从胶板制备开始到最后都应该在暗光下操作。制胶的步骤：现配现用NMA和LMA都用0.5％，如果容易脱胶可把浓度稍提高。用PBS把胶配好后放在水浴箱里。NMA：45摄氏度，LMA：37摄氏度水浴。就可以铺胶了。我用两层铺胶法：

6、第一层NMA：100微升，4度凝固5至8分钟；第二层LMA100微升加20微升细胞悬液，4度凝固5至8分钟，细胞悬液要先和LMA混合再铺胶。按照我的细胞浓度，100微升LMA里约有400个细胞，有时电泳没有跑开，细胞会显得很拥挤，所以还要注意电泳的电压和时间，电泳跑好了细胞就分布很均匀，这个细胞数正好。CometAssay最早发明时是中性电泳，只能检测到双链断裂，而后来在此基础上发展成碱性电泳，检测损伤范围更广，包括单、双链断裂、碱性不稳定点、DNA交联(DNAcross-links)及不完全切除修复位点等多种DNA损伤。对于毒因素的微DNA损伤更敏感。这个和细胞悬液制备及细胞

7、保存关系很大。细胞计数我用细胞计数板，不是很精确，估计一下就可以了。染色之后尽快在荧光显微镜下观察，因为荧光染料容易褪色，ＥＢ褪色没那么快，我有试过在染色冲洗后干燥条件下放了1.5个小时左右，变化不大。也可以先不染色，做到中和那一步，把片子固定，干燥条件下保存，等有时间再染色观察。固定一般用甲醇，你可以查查别人是怎么做的，这个我没有做过，我都是直接做到最后一步，每天从早上8点做到晚上9点，我觉得这样做效果比较好。细胞活力就是用台盼蓝检测了，活细胞不显色。如果你现在已经开始做试验了，告诉你一个