单细胞凝胶电泳(scge)技术

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1、单细胞凝胶电泳（SingleCellGelElectrophoresis，SCGE）技术单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（CometAssay）。它用于检测单个哺乳动物细胞DNA的损伤，与传统方法相比，因其快捷，灵敏，样品消耗少，费用较低，时至今日已广泛应用于各种有核细胞经受试因子作用后诱导出现的DNA损伤和修复的实验，成为遗传毒理学、氧化损伤、DNA交联损伤、放射生物学等领域中一项重要的研究工具。【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见

2、，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。1.SCGE的诞生（DNA损伤检测方法的研究）DNA损伤与修复是遗传毒理学及分子流行病学研究的一个重要目标，很久以前人们就在寻求一种合适的检测这一效应的方法。从使用DNA材料上分可将各种方法归为两类：（1）以裸DNA为材料检测，即通过去污剂、蛋白水解等方法去除附着于DNA上的其他细胞组分，分离出DNA；（2）以拟核为材料，即DNA构型（环区）保留于核骨架上，超螺旋结构不变

3、。SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。1984年由O

4、stling和Johanson首先介绍的SCGE技术在这些方面得到了显著改善，特别在1988年经Singh等完善的单细胞碱性微板电泳技术后，本方法已成为检测单个细胞DNA单链断裂的首选方法【2】。2.原理介绍有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着于核基质中,当细胞被琼脂糖包埋时，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其他生物膜破坏，细胞内的RNA、蛋白质及其它成分即进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍维持其环区附着于核骨架上，位置未发生迁移。当细胞为受损伤时，核DNA因分子量大，荧光染色后可

5、呈现圆形荧光团，无拖尾现象。但在DNA单链有断裂时，由于碱性电泳液可使DNA双链解螺旋并碱变性为单链，此时单链断裂的碎片由于分子量小，即可进入凝胶中，在电泳时离开核基质向阳极迁移形成拖尾，形似彗尾。且拖尾愈长，在相同电泳条件下，表示受损的断片越多，断片也愈小，即为核DNA受损越重【13】。通过测定DNA迁移的部分的光密度或迁移长度就可以测定DNA损伤程度，从而确定作用因素的剂量与损伤效应间的关系。3.操作程序【10】3.1凝胶的制备：准备0.5%的低融点琼脂糖和0.5%的正常融点琼脂糖（以无Ca2＋、Mg

6、2＋的PBS溶液配制）。将90ul的正常融点的琼脂糖加到4℃的载玻片上，并立即加盖玻片，待胶凝固后，移下盖玻片，加入75ul混有1000个/10ul细胞的低融点琼脂糖，盖上盖玻片，将玻片放入4℃冰箱内使胶迅速凝固，取下盖玻片，加上75ul低融点的琼脂糖作为第三层。再盖上盖玻片，放入冰箱中，以上操作均在黄光下进行，以防止DNA损伤。有关凝胶的制备在不同文献中方法有所差异，Schmezer【11】等曾有报道在玻片上预铺0.5ml正常融点的琼脂后再待其凝固，刮净后进行以上操作可增强第二、三层胶的附着性。另外在琼

7、脂糖的加入量上个实验室亦有所不同，有待统一化。3.2细胞的处理实验所需细胞悬液可由细胞培养或组织活检样品中获得，在加到凝胶中应达到（1～5）×10（4～6）/ml的细胞密度。通常以胎盼蓝拒染法测定。细胞存活率在95%以上者留用。由于胰酶消化及刮片等机械性分离亦有可能引起DNA损伤，故Singh【12】等推荐在玻片上贴壁培养单层细胞直接供测试用。根据不同实验目的，加受试物于培养液中。1.3细胞的裂解移去3.1中的盖玻片，将胶板浸于新配制的预冷的4℃细胞裂解液中至少1h（宜放于4℃冰箱中，裂解液成分为2.5m

8、ol/LNaCl,100mmol/LNaEDTA,10mmol/LTris－HCl,pH10.0和1%肌氨酸钠，用前加1%Triton和10%的DMSO）.1.4DNA展开、电泳轻轻取出裂解后玻片置于水平电泳槽内阳极端附近，玻片间不留空隙，用新配制的电泳液（含300mmol/LNaOH和1mmol/LNa2EDTA）完全盖过胶面。勿在凝胶上产生气泡。静置20min，待DNA充分展开后电泳（25V,300mA）,时间约20min