traf2在缺血性脑损伤中的作用及机制

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1、学校代码:10285学号:20134221146SOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文（学术学位）TRAF2在缺血性脑损伤中的作用及机制TheEffectsofTRAF2onstrokeoutcomes研究生姓名韦善文指导教师姓名程坚专业名称神经生物学研究方向缺血性脑损伤的保护及修复机制所在院部神经科学研究所论文提交日期2016年4月万方数据2万方数据万方数据4万方数据万方数据6万方数据TRAF2在缺血性脑损伤中的作用及机制中文摘要中文摘要目的：由大脑局部血供障碍引起的缺血性脑卒中会造成大脑组织缺血性组织及功能损伤。肿瘤坏死因子受体

2、相关因子（TRAFs）是一类接头蛋白，它们不仅和细胞表面的受体相互作用也和一些信号分子相互作用，从而在细胞的信号传导中起着非常重要的作用。TRAF2是TRAFs家族的一员，有研究报道，它可与鞘氨醇激酶1（SphK1）相互作用从而介导TNF-α通路和NF-κB通路。我们之前的研究证明，SphK1在脑缺血损伤中扮演着重要角色。本课题将探讨TRAF2是否也参与调控缺血性脑损伤。方法：我们以成年雄性ICR小鼠作为实验用动物，使用线栓阻塞小鼠大脑中动脉的方法（MCAO）建立脑缺血再灌注动物模型；利用神经元缺氧缺糖（OGD）后的条件上清（OGDNeur

3、onCM）激活小胶质细胞以模拟神脑缺血后脑内小胶质细胞的活化。我们利用实时定量PCR（Quantitativereal-timePCR，q-PCR）及免疫印迹法（Westernblot）检测小鼠脑缺血再灌注后皮层缺血半暗带区TRAF2mRNA及蛋白表达水平；利用免疫荧光技术（Immunofluorescencestaining）观察脑缺血后皮层区域表达TRAF2的细胞类型。通过大脑立体定位侧脑室注射干扰RNA（siRNA）降低TRAF2内源性表达，以2,3,5-tripheyltetrazoliumchloride（TTC）染色的方法研究T

4、RAF2对MCAO后24小时和96小时的脑梗死体积的影响及q-PCR法研究TRAF2对缺血后脑组织中促炎症因子表达的影响。我们又使用TRAF2的慢病毒转染原代小胶质细胞敲减TRAF2，然后检测OGDNeuronCM处理后的炎症水平；原代小胶质细胞经OGDNeuronCM和ZVAD处理可制成其Necroptosis模型；经TRAF2慢病毒转染的原代小胶质细胞的Necroptosis程度可由钙黄绿素-AM/溴化丙腚（Calcein-AM/PI）染色法检测。结果：1）与对侧等同区域的皮层、纹状体相比，脑缺血后小鼠大脑皮层、纹状体缺血半暗带区域的T

5、RAF2的mRNA及蛋白水平有显著地诱导上升；I万方数据中文摘要TRAF2在缺血性脑损伤中的作用及机制2）体外培养的原代小胶质细胞以神经元经OGD处理的培养基上清刺激后TRAF2mRNA水平上升，神经元OGD处理后TRAF2mRNA水平也显著上升；免疫荧光结果显示TRAF2信号集聚于缺血侧皮层的半暗带区域，同时，TRAF2与小胶质细胞标记（Iba1）和神经元标记(NeuN)共定位；3）以siRNA阻断TRAF2脑缺血后诱导升高降低MCAO后24小时、96小时后脑梗死体积；4）利用q-PCR发现，TRAF2siRNA注射组小鼠缺血再灌注24小

6、时后脑内炎症因子较sham组及NCsiRNA（无义siRNA）注射组小鼠显著降低；5）慢病毒敲减TRAF2对缺氧缺糖条件下小胶质细胞炎症因子表达无影响；6）经OGDNeuronCM处理后的原代小胶质细胞在ZVAD作用下发生死亡；7）OGDNeuronCM处理的原代小胶质细胞在ZVAD存在条件下发生Necroptosis；8）慢病毒敲减TRAF2后由OGDNeuronCM和ZVAD引发的原代小胶质细胞Necroptosis程度明显加重。结论：小鼠在缺血再灌注后神经细胞及小胶质细胞TRAF2表达升高；阻断TRAF2诱导表达降低缺血后脑梗死体积和

7、神经炎症应答；TRAF2表达被阻断后却缺氧缺糖条件下小胶质细胞的Necroptosis的增加可能是造成炎症下降的机制之一。我们的研究表明，抑制TRAF2减轻急性期缺血性脑损伤，TRAF2可能成为潜在的脑缺血治疗靶点。关键词：脑缺血；大脑中动脉阻塞模型（MCAO）；肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）；神经炎症；Necroptosis作者：韦善文指导教师：程坚教授II万方数据TRAF2在缺血性脑损伤中的作用及机制英文摘要TheEffectsofTRAF2onstrokeoutcomesAbstractObjective:Ischemics

8、trokecleadstobraintissuedamageandneurologicaldeficits.Tumornecrosisfactorreceptor-associa