实验4蛋白质的显色反应及蛋白质的变性与沉淀

《实验4蛋白质的显色反应及蛋白质的变性与沉淀》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、实验四蛋白质的显色反应及蛋白质的变性与沉淀【实验内容】1、蛋白质及氨基酸的呈色反应，2、蛋白质的沉淀及变性【实验目的】1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接形式。2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3、学习儿种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。4、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。5、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。6、了解蛋白质变性与沉淀的关系。【实验过程】一、蛋白质及氨基酸的显色反应1、双缩BR反应(1)原理：尿素加热至180°C左右，生成双缩服并放出一分子氨。双缩服在碱性条件下能与C+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩嫌反应。

2、蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩服相似,也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。nh2NH2180°CNH2C、Onh2反应式如下：NH2双缩聯-2N紫红色化合物双缩腺反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有，含有一个肽键和一个-CS-NH2,-CH2-NH2,-CHR-NH2,-CH2-NH2-CH-NH2-CH2-0H或-CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。毗也干扰此反应,因为Nib与C『•可生成暗蓝色的络离子Cu(NH3)因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩8R反应，但有双缩腺反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。

3、(2)试剂①尿素，②10%氢氧化钠溶液，③1%硫酸铜溶液，④2%卵清蛋白溶液(3)操作取少量尿素结品，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时,停止加热，尿素放11!氨，形成双缩服。冷后，加10%盘氧化钠溶液约lmL,振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。向另一试管加2%卵清蛋白溶液约lniL和10%氢氧化钠溶液约2mL,摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。2、卸三酮反应(1)原理蛋口质、多肽和各种氨基酸均能发生该反应，除无a

4、-氨基的肺氨酸和疑肺氨酸呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生成蓝色化合物。氨、B-丙氨酸和许多一级氨化合物都有此反应。因此，虽然蛋白质或氨基酸均有苗三酮反应，但能与苗三酮反应呈阳性反应的不一定都是蛋白质或氨基酸。该反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成C0八NH；i和醛，水合荫三酮被还原成还原型讳三酮；第二步是所形成的还原型讳三酮同另一个水合苗三酮分子和氨缩合生成有色物质。反应机理如卞:OHOHH2N-C—COOHnh3—°、H还原型茹三酮OHHO还原世茁三酮?

5、II00+3H2O蓝紫色该反应非常灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。但在定性

6、、定量测定中，一方面要严防干扰物存在，另一方面要在适宜的PH条件下进行测定。该反应的适宜的PH为5〜7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时其至不显色。（2）试剂①蛋白质溶液：2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水二1：9）,②0.5%甘氨酸，③0.1%卸三酮水溶液，④0.1%苗三酮-乙醇溶液。（3）操作①取两支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液ImL,再各加0.5mL0.1%前三酮水溶液,混匀，在沸水浴中加热1〜2分钟，观察颜色由粉色变紫色再变蓝色。②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1

7、%卸三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。3、黄色反应（1）原理含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醍酸钠。反应式如下Na+邻硝醒酸钠（橙黄色）多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以呈黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，须加入少量浓硫酸才有黄色反应。（2）试剂①鸡蛋清溶液（将新鲜鸡蛋清用6层纱布过滤，然后按鸡蛋清：水二1：20配制而成。②大豆提取液：将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。③头发。④指甲。⑤0.5%苯酚溶液。⑥浓硝酸。⑦0.3%色氨酸溶液。⑧0.3%酪

8、氨酸溶液。⑨10%@氧化钠溶液。（3）操作向7个试管屮分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。管号1234567材料鸡蛋清溶液人豆提取液指甲头发0.5%苯酚0.3%色氨酸0.3%酪氨酸浓硝酸4滴4滴少许少许4滴4滴4滴现彖4、考马斯亮蓝反应（1）原理考马斯亮蓝G25。具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色;当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室

9、温一小吋内稳定。在0.01~1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A弼凹值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。（