蛋白质的沉淀与变性反应

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1、實驗3蛋白質的沉澱與變性反應目的(1)瞭解蛋白質的沉澱反應、變性作用和凝固作用的原理及它們的相互關係。(2)學習鹽析和透析等生物化學的操作技術。原理在水溶液中，蛋白質分子的表面，由於形成水化層和雙電層而成為穩定的膠體顆粒，所以蛋白質溶液和其他親水膠體溶液相類似。但是，蛋白質膠體顆粒的穩定性是有條件的，相對的。在一定的物理化學因素影響下，蛋白質顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，則以固態形式從溶液中析出，這個過程稱為蛋白質的沉澱反應。這種反應可分為以下兩種類型:一、可逆澱汲反應在發生沉澱反應時，蛋白質雖已沉澱析出，但它的分子內部結構並未發生顯著變化，基本上保持原有的性質，沉

2、澱因素除去後，能再溶於原來的溶劑中。這種作用稱為可逆沉澱反應，又叫作不變性沉澱反應。屬於這一類的反應有鹽析作用;在低溫下，乙醇、丙酮對蛋白質的短時間作用以及利用等電點的沉澱等。二、不可逆沉澱反應在發生沉澱反應時，蛋白質分子內部結構、空間構象遭到破壞，失去原來的天然性質，這時蛋白質已發生變性。這種變性蛋白質的沉澱不能再溶解於原來溶劑中的作用叫作不可逆沉澱反應。重金屬鹽、植物鹼試劑、過酸、過鹼、加熱、震盪、超聲波，有機溶劑等都能使蛋白質發生不可逆沉澱反應。試劑和器材一、試劑1．蛋白質溶液取5m1雞蛋蛋白蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌均勻後用4-8層紗布過濾，新鮮配

3、製。2．蛋白質氯化鈉溶液取20ml蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液100ml，充分攪勻後，以紗布濾去不溶物(加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白)。硫酸銨粉末，飽和硫酸銨溶液，3%硝酸銀，0.5%醋酸鉛，10%三氯醋酸，濃鹽酸，濃硫酸，濃硝酸，5%磺基水楊酸(sulfosalicyclicacid)，0.1%硫酸銅，飽和硫酸銅溶液，0.1%醋酸，10%醋酸，飽和氯化鈉溶液，10%氫氧化鈉溶液。二、器材試管，試管架，小玻璃漏斗，濾紙，玻璃紙，玻璃棒，500ml燒杯，10ml量筒。操作方法一、蛋白質的可逆沉澱反應蛋白質的鹽析作用用大量中性鹽使蛋白質從溶液中沉澱析出的過程

4、稱為蛋白質的鹽析作用。蛋白質是親水膠體，在高濃度的中性鹽影響下，蛋白質分子被鹽脫去水化層，同時蛋白質分子所帶的電荷被中和，結果蛋白質的膠體穩定性遭受破壞而沉澱析出。析出的蛋白質仍保持其天然蛋白質的性質。減低鹽的濃度時，還能溶解。沉澱不同的蛋白質所需中性鹽的濃度不同，而鹽類不同也有差異。例如:向含有白蛋白和球蛋白的雞蛋清溶液中加硫酸鎂或氯化鈉至飽和，則球蛋白沉澱析出。加硫酸錢至飽和，則白蛋白沉澱析出。另外，在等電點時，白蛋白可被飽和硫酸鎂或氯化鈉或半飽和的硫酸銨溶液沉澱析出。所以在不同條件下，用不同濃度的鹽類可將各種蛋白質從混合溶液中分別沉澱析出，該法稱為蛋白質的分級

5、鹽析。目前在醃的生產和製備、科學研究工作和臨床化驗等工作中廣泛應用。取一支試管加入3m1蛋白質氯化鈉溶液和3m1飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置約10min，球蛋白則沉澱析出，過濾後向濾液中加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解，達到飽和為止。析出的沉澱為白蛋白。靜置，倒去上部清液，白蛋白沉澱，取出部分加水稀釋，觀察它是否溶解，留存部分作透析用。二、蛋白質的不可逆沉激反應1．重金屬沉澱蛋白質重金屬鹽類易與蛋白質結合成穩定的沉澱而析出。蛋白質在水溶液中是酸鹼兩性電解質，在鹼性溶液中(對蛋白質的等電點而言)，蛋白質分子帶負電荷，能與帶正電荷的金屬離子結合成蛋白質

6、鹽。在有機體內，蛋白質常以其可溶性的鈉鹽或鉀鹽的形式存在，當加入汞，鉛、銅、銀等重金屬鹽時，則蛋白質形成不溶性的鹽類而沉澱。經過這種處理後的蛋白質沉澱不再溶解於水中，說明它已發生了變性。重金屬鹽類沉澱蛋白質的反應通常很完全，特別是在鹼金屬鹽類存在時。因此，生化分析中，常用重金屬鹽除去體液中的蛋白質;臨床上用蛋白質解除重金屬鹽的食物性中毒。但應注意，使用醋酸鉛或硫酸銅沉澱蛋白質時，試劑不可加過量，否則可使沉澱出的蛋白質重新溶解。取2支試管，各加入約1m1蛋白質溶液，分別加入3%硝酸銀3-4滴，0.5%醋酸鉛1-3滴和0.1%硫酸銅3-4滴，觀察沉澱的生成。第一、二支試

7、管再分別加入過量的醋酸鉛和飽和硫酸銅溶液，觀察沉澱的再溶解。 2．有機酸沉澱蛋白質有機酸能使蛋白質沉澱。三氯醋酸和磺基水楊酸最有效，能將血清等生物體液中的蛋白質完全除去，因此得到廣泛使用。取兩支試管，各加入蛋白質溶液約0.5m1，然後分別滴加10%三氯醋酸和5%磺基水楊酸溶液各數滴，觀察蛋白質的沉澱。3．無機酸沉澱蛋白質濃無機酸(除磷酸外)都能使蛋白質發生不可逆的沉澱反應。這種沉澱作用可能是蛋白質顆粒脫水的結果。過量的無機酸(硝酸除外)可使沉澱出的蛋白質重新溶解。臨床診斷上，常利用硝酸沉澱蛋白質的反應，檢查尿中蛋白質的存在。取3支試管，分別加入濃鹽酸15滴，濃硫