代谢工程大肠杆菌积累丙酮酸的研究

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1、论文评阅人1：隆名迁室评阅人2：隆名谖宣评阅人3：隆名迁室评阅人4．答辩委员会主席：奎焦教援委员1：姚羞迳塾援委员2：挞丕强数援委员3：羞捡堑教援Author’Ssignature：Supervisor’SsignaturThesisreciewer1：．Theanonymousreview——Thesisreciewer2：．Theanonymousreview——Thesisreciewer3：．Theanony—mousreview—Thesisreciewer4：Chair：Prof．WeiLi．(Committeeoforaldefense)．Committe

2、eman1：￡!Q￡苎bi画ing]鱼QCommitteeman2：里!旦￡旦Q娶ggii皿gLi堕Committeeman3：Prof．YixinGuanDateoforaldefense：March2014DissertationsubmittedtoZhejiangUniversityForMasterdegreeofScienceinEnigineeringStudyonPyruvicAcidAccumulationbyMetabolic匕nflineeredEsCitenchiaC0"■-1-●一--‘■-WrittenbyDongqianShenMajori

3、nginBiochemicalEngineeringSupervisor6yShanjingYaoInstituteofBiologicalEngineeringZhejiangUniversity,HangzhouMaK2014独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得澎婆盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：孓也夕专；

4、萄签字口期：汐／中年多月／。口学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解迸婆盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权澎鎏盘堂‘口J．以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行柃索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：并匕毒浅导师签名：厂步∥签字日期：砂l啦年弓月／oEt签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：本课题受国家重点基础研究发展计划：生物炼制细胞工厂的科学基础(编号：2007

5、CB707805)资助摘要丙酮酸是生物代谢过程中承上启下的关键中间产物，为糖酵解途径的产物，同时它为糖酵解途径(EMP)和三羧酸循环(TCA)提供原料，丙酮酸可经多路途径产生甲酸、乙酸、苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸和丙氨酸等物质，并且为生物的各项生命活动提供所需的能量。野生型大肠杆菌发酵不会积累丙酮酸，然而对大肠杆菌进行代谢工程政造后，譬如tpdA基因敲除后的大肠杆菌可以积累丙酮酸。本文重点考察了tpdA基因敲除大肠杆菌(EscherichiacolitpdA’)在不同糖为碳源积累丙酮酸的情况，并通过优化培养基组成提高劬幽突变菌产丙酮酸的生产效率。在此基础上，考察了胞I为N

6、ADH／NAD+值与丙酮酸积累之间的关系，以及呼吸链末端氧化酶cyoA和cydB基因敲除对大肠杆菌生长，代谢途径上的影响，结果如下：在线控制pH为7．0，好氧条件下对lpdA突变菌利用不同糖原进行分批发酵，葡萄糖，果糖、木糖和甘露糖都可以被lpdA突变菌在基本培养基中利用，并积累大量丙酮酸，得率分别达到了0．884g／g，0．802g／g、O．引7∥g和0．808g／g，并且丙酮酸的积累在葡萄糖、果糖和木糖发酵过程属于生长偶联型，甘露糖发酵产丙酮酸过程属于部分偶联型发酵。基本培养基混合1％，5％，10％和20％LB培养基组成下，加幽突变菌发酵葡萄糖生产丙酮酸的能力，发现

7、10％的LB添加量是lpdA突变菌发酵较为合适的条件。在此条件下，10g／L葡萄糖发酵结束所需时间由不加LB培养基时的7lh缩短至12h，生产效率由0．080g．L4-h。提高到0．525g-L-1．h。1提高了556％。核黄素、吡哆醇和烟酸的适量补充也能提高丙酮酸生产效率。在大肠杆菌中，较低的NADH／NAD+值有利于丙酮酸的积累以及减少副产物的生成。进一步分析发现，对于勿幽突变菌而言，NADH／NAD+值与丙酮酸得率有关，而与生产效率无关。大肠杆菌cydB突变菌在合成培养基分批发酵时，进入对数生长期后，细胞快速生长，最终细胞浓度达到5