定向改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究硕士学位论文

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1、天津科技大学研究生学位论文(申请硕士学位)定向改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究STUDYONDIRECTELYTANSFORMSACCHAROMYCESCEREVISIAEFORACCUMULATEPYRUVICACID专业名称：发酵工程申请学位级别：工学硕士摘要丙酮酸是一种重要的有机酸，它广泛地应用于化工原料、药物及农用化学试剂的生产和研究中。目前生产丙酮酸的方法主要有化学合成法、生物催化法和生物发酵法。化学合成法、酶催化法合成具有原料难得、结构复杂、成本较高，不适于大规模生产，而且合成的丙酮酸酸多为外消旋混合物等缺点，因此利用微生物法合成丙酮酸

2、酸成为发展趋势。发酵法生产丙酮酸的主要研究思路和目标是：（1）减少丙酮酸的进一步降解及转化；（2）加快发酵底物葡萄糖的酵解速度，提高生产强度。酿酒酵母作为一种研究和应用最为广泛的真核微生物，发酵生产乙醇具有极好的优势。在厌氧条件和溢出代谢情况下，经糖酵解生成的丙酮酸几乎全部或大部分流向生产乙醇的支路，从而产生乙醇的积累；同时酵母细胞具有较高的耐受性，可以积累较高浓度的乙醇。通过合理利用产乙醇的代谢流向，将乙醇的代谢流引向丙酮酸的积累，为丙酮酸的生产提供了新的思路。本论文就是研究定向阻断酿酒酵母丙酮酸的进一步代谢，从而积累丙酮酸。以菌株S.cer

3、evisiaeY2为出发菌株，把pdc1基因敲除片段用电穿孔转化法转化到出发菌株S.cerevisiaeY2中，在含G418抗性的YEPD平板上筛选转化子，通过PCR验证得到pdc1基因的敲除菌株S.cerevisiaeY21△。然后把pdc5基因敲除菌株敲除片段用醋酸锂转化法转入到S.cerevisiaeY21△中，在YNBG平板上筛选转化子，通过PCR验证得到pdc1和pdc5基因都缺失的菌株S.cerevisiaeY21△5△。然后用southernblot进一步验证S.cerevisiaeY2pdc1和pdc5基因的缺失。为比较丙酮酸脱

4、羧酶基因敲除后酶活的变化，分别测定S.cerevisiaeY2，S.cerevisiaeY21△和S.cerevisiaeY21△5△的丙酮酸脱羧酶的活性，结果发现S.cerevisiaeY21△和S.cerevisiaeY21△5△的丙酮酸脱羧酶的活性较S.cerevisiaeY2分别减少了31%和98%。对基因敲除菌株和出发菌株进行简单发酵实验，结果发现丙酮酸的产量有显著提高，S.cerevisiaeY2，S.cerevisiaeY21△和S.cerevisiaeY21△5△的发酵120h的丙酮酸产量分别为1.24g/L、2.894g/L、

5、9.264g/L。为进一步提高S.cerevisiaeY21△5△的丙酮酸产量，对其种子培养基、发酵培养基和发酵条件进行了优化，优化后种子培养基为（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨10，酵母粉5，KH2PO41，MgSO4·7H2O0.5，醋酸钠2，玉米浆0.5%，pH5.6；优化后发酵培养基为（g/L）：葡萄糖80，蛋白胨20，酵母粉10，醋酸钠2.5，玉米浆1%，KH2PO41，MgSO4·7H2O0.5，金属离子母液5mL，pH5.6；最佳发酵条件为：种龄26h、接种量12%、装液量70mL/250mL三角瓶，发酵96h。S.cerevisi

6、aeY21△5△在最佳发酵条件下丙酮酸的积累量为24.85g/L，比优化前提高168%。关键词：丙酮酸；基因敲除；酿酒酵母；代谢工程；丙酮酸脱羧酶ABSTRACTPyruvicacidisanimportantorganicacid,whichwidelyusedinproductionandresearchofchemicalrawmaterials,pharmaceuticalandagriculturalchemicalreagentsmedicinandagrochemicals.Currently,themethodsforprodu

7、ctpyruvicacidincludechemicalsynthesis,biocatalysisandbiologicalfermentation.However,thecommonchemicalsynthesisandenzymaticsynthesisarenotsuitableformassproductionofpyruvicacidbecausetheyhavemanyshortcomings:therawmaterialsarerare,complex,costlyandtheproductsalwaysisaracemicm

8、ixture,sotheuseofmicrobialsynthesisofpyruvicacidisatrend.Themainideasandobj