rgs4蛋白在不同表达体系中对阿片受体信号转导途径的影响及其在细胞内定位的初步研究

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1、中国协稿1医科大学博{j学位论文英文缩略语英文全称中文全称2ACCK¨PAdenylateCyclase腺苷酸环化酶Adenosine一3、，5、cyclinmonophosphate环磷酸腺苷3H—cAMP3H．1abeledadenosine．3，5cyclicmonophosphateDAMGOTyr-D—Ala—Gly-N—Methyl—Phe-Gly—01．Enkephalinanalogwhichselectivelybindstou—opioidreceptor3H标记的环磷酸腺苷u．受体特异性激动剂EGFP

2、Enhancedgreenfluorescenceprotein增强的绿色荧光蛋白HEK一293cellhumanembryonickidneycell293人胚胎肾细胞GAPGAIPGPCRGRKDcDNA3GTPaseactivatingproteinsGTP酶激活蛋白GetineractingproteinGcz亚单位反应蛋白G-proteincoupledreceptorsG蛋白偶联受体G-proteincoupledreceptorkinasesG蛋白偶联受体激酶携带氨苄青霉素和新霉素抗性基因的质粒pEGFP—C

3、1携带增强绿色荧光蛋白和卡那抗性的质粒RGSregulatorsofGproteinsignalingG蛋白信号调节子中羽协和医科人学fl!ff岸位论史一3中文摘要RGS’(regulatorofGproteinsignalling)蛋白是近年来发现的一，类对G蛋白信号转导过程起调节作用的蛋白。rG蛋白的信号转导是G蛋白偶联的受体(GPCR)将细胞外信息传入细胞内的过程，鸟菅酸酶循环(GTPasecycle)是其主要的调节机理之一。GTP酶激活蛋白(GAP)通过促进G蛋白的a亚单位的GTP酶活性而加速活化型G蛋白(Gct-

4、-GTP)所结合的GTP分解，导致活化型的G蛋白作用时间的缩短而调节G蛋白信号转导过程。RGS蛋白家族亦属于GAP蛋白中的一员。{阿片受体是G蛋白偶联的七螺旋跨膜受体，盆要7““、6、K三种亚型1，目前认为，参与三种受体信号转导的G蛋白主要是Gi／02一。阿片受体活化后，其效应器之一为腺苷酸环化酶(AC)，阿片受体激～。。矿活后通过Gi／o及Gz蛋白的介导抑制腺苷酸环化酶的活性。j研究比较，瞬时表达的RGS4蛋自在瞬时表达和稳定表达u受体的HEK--293细胞中对“受体激活后腺苷酸环化酶抑制的影响，来验证RGS4蛋白的表达

5、后的功能情况。比较RGS4蛋白在稳定表达n阿片受体的HEK。293细胞体系中和在共转染扯阿片受体的HEK．293细胞体系中对G蛋白信号途径的影响。并构建pEGFP—RGS4质粒，通过荧光显微镜技术对RGS4蛋白的分布进行细胞内定位。从酶切结果看，目的基因RGS4片段已经联入pEGFP。CI中，将中国卧和医科人学博I?学位论文一4此质粒转染至HEK一293细胞中，通过荧光显微镜证实RGS4蛋白主要以胞浆分布为主。用放射性蛋白竞争结合法分析AC活性，在瞬时表达儿受体和RGS4蛋白的空HEK一293细胞体系中，RGS4可显著影响

6、G蛋白的信号转导，从而对AC活性产生影响；而在稳定表达LL受体的HEK．293体系中，从目前结果看，RGS4对G蛋白信号通路的影响不明显。关键词：RGS，G蛋白，AC，阿片受体!堕坠翌堕型叁兰堕!：兰堡堡苎一一一5AbstractGproteincoupledreceptors(GPCR)transformtheextracellularsignalstointracellularsignalsthroughGproteinspathways．Guanosinetriphosphatasecycle(GTPasecycle

7、)whichcontrolsthehydrolyzeofasubunitboundGTPisoneofthemainspeedlimitedstepsoftheactivationofGproteins．GTPhydrosisisacceleratedbyGTPase—activatingproteins(GAPs)．RegulatoryGproteinssignalingprotein(RGSprotein)isafamilyofproteinswhichregulatetheGTPaseofG。proteinsThet

8、hreesubtypesofopiatereceptors(¨6、K)areallsevenserpentinetransmembraneGPCRs．Theireffects，includingtheinhibitionofadenylatecyclase，areconsideredtobemediat