大鼠海马神经元中μ阿片受体、cck受体的表达及慢性吗啡作用对其表达的影响

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1、大鼠海马神经元中μ阿片受体、CCK受体的表达及慢性吗啡作用对其表达的影响【摘要】目的:研究MOR1，CCKAR，CCKBR在海马神经元的分布和吗啡对其受体的影响.方法：用激光共聚焦扫描技术，以神经元特异性标记抗体NF200对原代海马神经元进行鉴定，采用特异性的MOR1，CCKAR，CCKBR的抗体观察观察它们在海马神经元上的表达.选用雄性OR1，CCKAR及CCKBR；给予吗啡后2~4d，MOR1在海马神经元上的表达较对照增高(P<0.05)，5d时，MOR1的表达显

2、著下降(P<0.01)；随吗啡作用时间延长，CCKAR和CCKBR在海马神经元的表达呈上调趋势，且CCKBR的表达高于CCKAR(P<0.01).结论：海马神经元上同时存在MOR1，CCKAR和CCKBR，吗啡作用时间越长，MOR1表达越弱，而CCKAR和CCKBR表达越强.【关键词】阿片受体；CCKA受体；CCKB受体；吗啡依赖；原代海马神经元；激光共聚焦；流式细胞术　　0引言　　研究表明μ受体（MOR1）是吗啡等阿片类物质的主要作用位点，镇痛活性最强，成瘾

3、性也最强［1-2］.另有实验研究表明：在中枢神经系统中广泛分布着一种典型的脑肠肽－胆囊收缩素(cholecystokininoctapeptide,CCK)，它是脑内含量最高的一种神经肽［3］，其通过CCK受体发挥生理作用.实验已证实：CCK受体拮抗剂不但能针对戒断症状进行对症治疗，而且有一定程度的防止复吸作用［4］，但具体机制尚未完全阐明.本研究采用不同的实验技术，重点阐明MOR1,CCKAR及CCKBR是否存在于海马神经元上以及吗啡在不同的时间点对3种受体的影响，为进一步研究CCK受体拮

4、抗剂对吗啡依赖大鼠戒断症状的影响及其机制的研究奠定必要的基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　健康雄性OR)，沈阳第一制药厂生产，批号：辽宁药准字(1996)第002747号.DMEM培养基、NeurobasalMedium，B27(美国Gibco公司)；山羊抗CCKA，山羊抗CCKB抗体，兔抗MOR1多克隆抗体，FITCdonkeyantimouseIgG，BiotindonkeyantirabbitIgG(美国SantaCruz公司)；TRITCrabbitantigoa

5、tIgG，FITCrabbitantigoatIgG，FITCgoatantirabbitIgG(北京中山生物公司)；CY5antirabbitIgG(Camical公司)；小鼠抗NF200单克隆抗体(NEOMARKERS公司)；兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；激光共聚焦显微镜(德国LEica)；EpicsXL流式细胞仪(美国BeckmanCoulter).　　1.2方法　　1.2.1原代大鼠海马神经元培养　　取出生1d的大鼠在无菌条件下

6、分离海马组织，制备细胞悬液，用含B27Supplement的NBM进行原代海马神经元培养.　　1.2.2神经元鉴定　　取培养6d的大鼠海马神经元，用免疫荧光标记技术进行鉴定，一抗分别为GFAP多克隆抗体和NF200单隆抗体，二抗分别为BiotindonkeyantirabbitIgG＋CY5antidonkeyIgG和FITCdonkeyantimouseIgG，标记后选择不同视野细胞进行激光共聚焦扫描40ｘ（激发波长488nm，发射波长530nm）.　　1.2.3MOR1，CC

7、KAR，CCKBR在海马神经元的表达　　将原代海马神经元随机分为NF200/MOR1，NF200/CCKAR，NF200/CCKBR3组，特异性抗体同上，用免疫荧光标记和激光共聚焦扫描技术检测受体的表达.　　1.2.4MOR1，CCKAR，CCKBR在吗啡处理大鼠海马神经元的表达　　1.2.4.1给药与分组　　60只健康雄性1～M9组（分别给予MOR1~9d），大鼠参照　　2.2MOR1,CCKAR及CCKBR在海马神经元的表达　　在海马神经元膜，轴突和树突上均有发蓝色荧光的

8、MOR1阳性表达产物（图2A，D）；绿色荧光标记物与红色荧光标记物重叠之后呈橙黄色荧光，CCKA,CCKB受体呈橙黄色标记,在海马神经元膜表面广泛分布（图2B，C，E，F）.　　2.3吗啡对大鼠海马神经元MOR1,CCKAR,CCKBR表达的影响　　采用流式细胞技术检测给予吗啡后MOR1，CCKAR，CCKBR在海马神经元上的表达.给予吗啡2d时MOR1上调(P<0.05)，5d时MOR1开始出现下调，蛋白表达量显著下降(P<0.01)，并呈时间依