应用rnai技术沉默stat1基因对哮喘小鼠inf-γ、il-5、icam-1表达的影响

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1、中图分类号：R562.2+5硕士学位论文应用RNAi技术沉默STAT1基因对哮喘小鼠INF-γ、IL-5、ICAM-1表达的影响院（系）、所临床医学院研究生姓名刘春凤学科、专业内科学导师姓名熊瑛教授二Ο一二年三月目录应用RNAi技术沉默STAT1基因对哮喘小鼠INF-γ、IL-5、1ICAM-1表达的影响…………………………………………11.1中文摘要………………………………………………………31.2英文摘要………………………………………………………51.3前言……………………………………………………………71.4材料与方法……………………………………………………131.5结果……………………

2、………………………………………221.6讨论……………………………………………………………311.7结论……………………………………………………………371.8参考文献………………………………………………………381.9英汉缩略词对照表……………………………………………422致谢……………………………………………………………44RNA干扰技术在支气管哮喘研究中的应用及进展（综3述）……………………………………………………………46应用RNAi技术沉默STAT1基因对哮喘小鼠INF-γ、IL-5、ICAM-1表达的影响摘要[1]目的：STAT1参与调节多种细胞因子和生长因子的细胞反应，是连接各种

3、膜受体和效应器之间的信号转导途径。它主要是调节细胞的增值、分化、凋亡。在哮喘的发病中JAK/STAT信号通路也起着重要的作用。有研究表明，机体STAT1的表达水平对免疫的调节和炎[2]症反应起着决定性的作用。因此目前在呼吸系统的疾病中对JAK/STAT信号通路的研究同样集中在哮喘上。正因为JAK/STAT信号通路存在细胞因子特异性，因此阻断某种JAK/STAT通路就可以阻断其相对应的细胞因子的作用。RNA干扰是一种强有效的抑制基因功能的工具。它能够促进靶基因的转录产物mRNA的降解，进而阻止mRNA翻译成相应的蛋白质。本实验应用RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)沉默转导

4、子与转录活化子1(signaltransducerandactivatoroftranscription1STAT1)基因，探讨其对支气管哮喘小鼠STAT1蛋白与INF-γ、IL-5、ICAM-1的表达的影响。使基因治疗成为可能导致治疗或者甚至预防性治疗支气管哮喘等气道慢性炎症性疾病的新方法。方法：32只4周龄BALB/C雌鼠随机分为4组；分别为正常组、PBS组、空质粒组(随机片段RNAi)和siRNA组(pG-2)。PBS组、空质粒组和siRNA组分别用新鲜配制的OVA/Al(OH)3混悬液(100ugOVA+1mgAl(OH)3干粉加入1mlPBS液配制而成)，分别于第1天和第14天腹腔注

5、射OVA/Al(OH)3混悬液，使BABL/C小鼠致敏；而正常组用1mL的生理盐水腹腔注射。在第26-29天siRNA组浓缩的siRNA40ul(100ug)滴鼻；PBS组用40ulPBS液滴鼻；空质粒组用随机片段RNAi40ul滴鼻。正常组用生理盐水滴鼻。在第28-30天正常组用生理盐水滴鼻，PBS组、空质粒组及siRNA组用OVA溶液50ul(50ug)滴鼻激发哮喘，在末次滴鼻后12小时引颈处死小鼠。通过单肺灌洗留取肺泡灌洗液(BALF)进行细胞计数和分类计数。取BALF上清液，应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法(ELISA)，检测其中的γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素5(IL-5)、细胞

6、间粘附分子1(ICAM-1)的表达水平。肺组织切片做免疫组织化学染色及HE染色。采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析和随机区组设计的方差分析，多个样本均数之间的多重比较用LSD法，以P<0.05表示有统计学意义。同时分析BALF中炎症细胞数与IFN-γ，IL-5，ICAM-1间相关性。结果：(1)正常组小鼠肺组织切片HE染色可见；支气管内壁光滑，肺泡间隔菲薄，肺泡腔内未见炎性渗出物。空质粒组及siRNA组哮喘小鼠肺组织病理切片HE染色可观察到：支气管粘膜水肿，支气管及血管周围有大量的炎症细胞的浸润，以Eos为主；肺间质及肺泡腔内也可见Eos的浸润。细、小支气管内可见黏液栓。气道上皮多处断

7、裂，基底膜明显增厚且形态不规则。而siRNA组炎症细胞的浸润及黏液的分泌较空质粒组与PBS组比较明显减轻。(2)STAT1蛋白主要表达与小鼠的气道上皮细胞。(3)siRNA组STAT1蛋白表达水平明显低于PBS组及空质粒组，但高于正常组。IL-5、ICAM-1的表达水平亦呈类似改变，而IFN-γ则呈相反的改变。(4)正常组的肺泡灌洗液中白细胞数，嗜酸性粒细胞(EOS)以及淋巴细胞(LC)数量较PB