小西葫芦黄化花叶病毒罗汉果分离株及转基因罗汉果的研究

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1、广西大学博士学位论文小西葫芦黄化花叶病毒罗汉果分离株及转基因罗汉果的研究姓名：朱英芝申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：陈保善201206小西葫芦黄化花叶病毒罗汉果分离株及转基因罗汉果的研究摘要小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus，ZYMV)为马铃薯Y病毒科Y病毒属的成员之一，是葫芦科作物重要的病原病毒之一。ZYMV单独或与其他病毒一起侵染罗汉果，引起罗汉果(Siraitiagrosvenorii)病毒病。为了明确罗汉果ZYMV(zYMV-LHG)病毒病的流行规律和侵染源，

2、本研究开展了罗汉果全生育期田间病毒病发生情况监测，并对罗汉果田块内和周边植物进行广泛的病毒血清学检测；对来自不同罗汉果种植区的侵染罗汉果的ZYMV的外壳蛋白(CP)基因序列进行分析，以明确ZYMV-LHG在分子水平上的分化程度；同时，对罗汉果抗病毒转基因方法进行了初步探索。本研究于2006年5月、7月和9月分别对广西桂林的永福和广西柳州的融安两地的7个罗汉果果园进行了罗汉果全生育期田问病毒病发病率调查。在生长前期，宿根苗已全部发病，但组培苗均未见发病；生长中期，有宿根苗的果园的病毒病发病率已经达到100％，田问长势相

3、对较弱，与其邻近的果园发病率也远远高于周围无宿根苗的果园。生长后期，所有罗汉果果园都能看到发病罗汉果植株，发病率从0．8％到100％不等。用提纯的ZYMV-LHG病毒粒子免疫新西兰大白兔，获得效价1：16000的抗血清。用ZYMV-LHG抗血清对罗汉果果园及周围植物进行带毒率检测，在46科96属的114种植物中，发现分别属于葫芦科、苋科、豆科、菊科、禾本科、蓼科、锦葵科、鸭跖草科和茜草科共9个科的部分植物呈阳性反应，植物阳性检出率与田间罗汉果的病情发展趋势一致，表明ZYMV-LHG有较广泛的自然寄主范围。对罗汉果种子

4、传播ZYMV-LHG的效率进行了测定。结果表明，ZYMV不能够通过罗汉果种子进行传播或者其传播的概率很低。为了解ZYMV-LHG的进化规律，对从桂林的永福、龙胜和兴安三个县的15个果园采集的表现典型花叶病症状罗汉果的ZYMV-LHG的不同分离物进行了基因序列分析。以病叶总RNA为模板，通过RT-PCR的方法获得17条来源于独立样品ZYMV-LHG的外壳蛋白(CP)基因序列，它们的核苷酸序列同源性为92．1％．100％，氨基酸序列同源性为96．4％一100％。利用Dnasp进行分析，发现ZYMV-LHGCP基因的5’端

5、具有较高的多样性，Tajima’SD统计值为0．44664，表明ZYMV-LHG核苷酸序列的进化为平衡选择，没有群体扩张的倾向。此外，这17条序列的蚜传保守DAG基序均未发生改变，暗示它们均可以通过蚜虫传播。线性抗原表位预测显示，在ZYMV-LHG的CP的N端，线性抗原表位发生较多变化，17个分离物可以分为6种不同的抗原类型，其中I型最多，包括了6、7、8、9、12、N10一l和N10—4共7个分离物。用基于距离的邻近法(neighborjoining，NJ)构建系统进化树和用贝叶斯-马尔科夫链．蒙特卡洛方法(Bay

6、esiaMCMC)对ZYMV-LHG的最近共同祖先出现时间进行了估计。世界各地已报道的ZYMV的各种株系的最近共同祖先的出现时间为736年(95％HPD，256—1357年)，核酸替代率为1．7×104替代／每位点／每年(95％HPD，O．723—3．11×10‘4替代／每位点／每年)。MCC树分析表明，，而本研究获得的ZYMV-LHG分离物主要归于两个基因簇群，并且没有明显的杂和其他来源的病毒，ZYMV-LHG在进化上处于比较保守的位置。本研究比较了罗汉果子叶、罗汉果实生苗叶盘和罗汉果组培苗叶盘三种外植体的再生频率

7、，发现罗汉果子叶具有再生能力强，再生效率高的特点，最适合作为罗汉果转化体系的外植体，以罗汉果子叶为外植体，60mg／L的卡那霉素(km)浓度为筛选压力。本研究所构建的罗汉果遗传转化系统，为今后罗汉果基因工程抗病毒育种奠定了初步基础。选择ZYMV的NIb和CP最保守的区域并分析它们的二级结构后，确定并获得了转基因用RNAi所需的目的片段。以pBll21为载体，构建分别携带ZYMV的NIb和CP的RNAi片段的双元表达载体pBIl21ZYMVCPRNAi和pBll21ZYMVNIbRNAi。通过农杆菌介导的方法，把ZYM

8、V的CP、NIb基因导入到罗汉果中，共获得了258棵转基因罗汉果植株，其中转pBll2tZYMVCPRNAi的转基因苗有139棵，转pBll21ZYMVNIbRNAi的转基因苗有119棵。关键词：小西葫芦黄化花叶病毒；抗血清；寄主检测；进化分析；同源性；RNAi；转基因StudiesonLuohanguo—infectingZucchihiye