徐淮山羊h-fabp基因克隆及转基因小鼠和转基因羊的制备

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1、国家转基因重大专项TheProjectSupportedbyNationalNewVarietiesofGMOcultivation转基因肉羊育种新材料创制(No．2008ZX08008—003；No．2009ZX08008—003B)徐淮山羊H．FABP基因克隆及转基因小鼠和转基因羊的制备研究生：阴彦辉导师：李碧春专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009)中文摘要脂肪酸结合蛋白家族(FattyAcid—Bindingproteins，FABPs)是一类小分子量蛋白，大小约为12．16KDa，该

2、蛋白家族属于载脂蛋白超家族(Lipocalinsuperfamily)，是一类脂肪酸转运蛋白。该蛋白家族最早是1971年美国加州大学的Ocker等在研究大鼠的脂肪酸吸收的调节时，在小肠肠粘膜发现。到目前为止已经发现十一种亚型，根据其主要分布器官和组织不同，主要分为：肠型(Intestinal，I-FABP)、心脏型(Heart，H．FABP)、肝脏型(Liver，L．FABP)、脂肪细胞型(Adipocyte，A—FABP)、脑型(BrainFABP)、表皮型(EpidermalFABP)、回肠型(IlealFABP)、髓磷

3、脂型(MyelinFABP)、’肾型(RenalFABP)、睾丸型(testisFABP，T—FABP)脂肪酸结合蛋白以及细胞视黄醇结合蛋白(CellRetinoidBindingProtein，CRBP)和细胞视黄醇酸结合蛋白(CellRetinoidAcidBindingProtein，CRABP)。不同的亚型之间具有较强的同源性。该蛋白家族占细胞内可溶性蛋白总量的3％．8％。主要参与细胞内脂肪酸的运输，可将脂肪酸从细胞膜上运送到甘油三酯和磷脂合成的位点，进而调节脂肪酸代谢。心脏型脂肪酸结合蛋白(heartfattyac

4、idbindingprotein，H—FABP)在脂肪酸结合蛋白家族中分布最广泛，作用也最为重要。它主要存在于3种细胞之中：(1)D氧化速率高的细胞(如心肌、骨骼肌细胞)；(2)脂肪代谢强度高、尤其是类固醇合成旺盛的细胞(如内分泌系统的肾上腺皮质细胞、泌乳的乳腺)；(3)内胚层起源的细胞。在心肌中含量最为丰富，约占心脏全部可溶性蛋白的4％．8％。其主要作用是防止细胞内堆积游离脂肪酸。该蛋白是一种可溶性细胞质蛋白，分子量为14．15KDa。H．FABP是一种酸性蛋白质，在不同的物种之间具有较强的保守性。人H．FABP的一级结构

5、由132个氨基酸残基组成，牛、羊、野猪、小家鼠等H．FABP的一级结构由133个氨基酸残基组成。本研究克隆出徐淮山羊H．FABP基因CDS，并针对其进行一系列分析。结果显示：徐淮山羊H．FABP基因CDS共有402bp，编码133个氨基酸，蛋白分子量大小为14．76kDa，等电点为6．369，是一种酸性蛋白。徐淮山羊H．FABP基因序列和氨基酸序列与根据GenBank上报道的人、鸡、褐家鼠、奶牛，野猪、驴及斑马鱼进行同源性比较，可知该基因在不同的物种之间具有较高的保守性。该蛋白无信号肽，无糖基化位点，但是存在8个磷酸化位点。

6、通过GFP示综蛋白和间接免疫荧光双重检测，结果证实徐淮山羊H．FABP蛋白在细胞质中表达。通过睾丸注射法，将携带有徐淮山羊H．FABP的重组载体转入雄性小鼠睾丸内，然后将雄鼠和空怀母鼠合笼，获得GO代小鼠，经过DNA和蛋白水平检测，最终获得4％(7／175)的阳性个体。将GO代阳性个体自交获得G1代小鼠，经过DNA和蛋白水平检测，最终获得30．23％(13／43)的阳性的阳性个体。将GO和G1阳性个体采集心肌、腿肌和背最长肌，并测定其肌间脂肪含量，结果显示阳性个体较阴性个体肌间脂肪含量显著偏高。结果说明：外源基因的生物学功能

7、在小鼠水平得到充分发挥。利用显微注射法制备转基因羊，将徐淮山羊H．FABP基因转入波尔山羊成纤维细胞中，经过G418获得阳性细胞系。将阳性细胞作为核供体注射入成熟去核卵母细胞中，再将重组胚胎植入受体母羊子宫中，并获得4例阳性流产胎儿和一只活体阳性羔羊，阳性率为83．33％。参照睾丸注射制备转基因小鼠的基本思路，采用睾丸注射制各转基因羊。获得17只F1代个体，3只阳性个体，阳性率为17．65％。关键词：徐淮山羊，H．FABP，睾丸注射，显微注射，转基因羊，转基因小鼠XuhuaigoatH·-FABPgenecloningand

8、preparationoftransgenicmiceandtransgenicgoatM．S．Candidate：YanhuiYinAdvisor：Prof．BichunLiMajor：AnimalGenetics，BreedingandReproduction(CollegeofAni