克隆徐淮山羊scd1基因及转基因小鼠和转基因绵羊的制备

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1、国家转基因重大专项TheProjectSupportedbyNationalNewvarietiesofGMOcultivation转基因肉羊育种新材料创制(No．201ZX08008-003；No．2009ZX08008—003B)克隆徐淮山羊SCDl基因及转基因小鼠和转基因绵羊的制备至究羔：量三兰IIYl2lll4lIlllIIIl9iLLJ7i9LLIll7llUl导师：李碧春。-。。’⋯专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009)中文摘要硬脂酰辅酶A脱氢酶(Stearoyl．CoAdesaturase，SCD)是存在

2、于内质网膜上的跨膜蛋白酶，是一种微粒体蛋白酶，属于脱氢酶家族。哺乳动物SCD基因的cDNA首次在小鼠肝脏中发现，在小鼠中SCD存在4种异构体，分别是SCDl～SCD4，它们分别编码355、358、359和352个氨基酸。在正常的饮食条件下，SCDlmRNA在白色脂肪组织、褐色脂肪组织、睑板腺、哈德腺和包皮腺中高度表达，并且在肝脏和心脏中可被高碳水化合物显著诱导。SCDl是脂肪代谢中的重要酶，是催化由饱和脂肪酸(SFA)合成不饱和脂肪酸(MUFA)的限速酶，在脂肪酸生物合成中起着中心调节作用。脂类中饱和脂肪酸(SFAs)与不饱和脂肪酸(MUFAs)的比例

3、影响脂蛋白代谢、生物膜流动性和信号传导，进而与糖尿病、动脉粥样硬化、癌症、肥胖症等多种疾病相关，因此SCDl在近年成为研究热点。研究发现，SCDl可能影响奶中SFAs／MUFAs比率、肌间脂肪沉积和成分，是改善乳品品质和肌肉质量的主要候选基因。肌间脂肪中不饱和脂肪酸含量的提高对于肉品质和肉风味的改善也有着重要影响，而且不饱和脂肪酸与人类健康也有密切的关系。本研究克隆出徐淮山羊SCDl基因CDS并对其进行了生物学信息分析，进行体外表达、亚细胞定位研究，最后通过睾丸注射法介导SCDl基因制备转基因小鼠和转基因绵羊。主要研究内容如下：1．克隆SCDl基因、生

4、物学信息分析及构建真核重组表达载体。设计扩增SCDl基因特异引物，采用RT-PCR方法从徐淮山羊脂肪组织中克隆出SCDlII基因eDNA。将扩增产物克隆至pMDl9．T载体中，测序与酶切结果表明pMDl9．T-SCDl构建正确。将SCDl基因克隆至真核表达载体pEGFP．C1中，构建重组真核表达载体pEGFP．SCDl，酶切与测序结果均表明pEGFP．SCDl构建正确。生物信息学分析结果表明：徐淮山羊SCDl基因CDS区共有1074bp，编码357个氨基酸，蛋白分子量大小为41．35kDa，等电点为7．0，GenBank登录号为JX854036。徐淮山

5、羊SCDl基因序列和氨基酸序列与GenBank上报道的人、褐家鼠、小家鼠、绵羊、山羊、牛和野猪进行同源性比较，可知该基因在不同物种之间有较高的保守性。2．重组真核表达载体pEGFP．SCDl体外表达及其亚细胞定位研究。采用脂质体重组融合表达载体pEGFP．SCDl转染NIH．3T3细胞，48h后在荧光倒置显微镜下直接观察绿色荧光在细胞中的位置，并提取细胞总RNA。用软件预测和RT-PCR方法鉴定该融合蛋白在细胞中的表达情况。软件预测结果显示SCDl蛋白主要在细胞质中表达。在倒置荧光显微镜下观察，重组SCDl蛋白的荧光分布在细胞质内，细胞核内无荧光；RT

6、-PCR结果显示重组表达载体在NIH．3T3细胞中得到表达。3．制备携带SCDl基因的转基因小鼠。通过睾丸注射法，将携带有徐淮山羊SCDl的重组载体转入雄性小鼠睾丸内，然后将雄鼠和空怀母鼠合笼，获得Fl代小鼠，经过DNA和蛋白水平检测，最终获得6．67％的阳性个体。将Fl代阳性个体自交获得F2代小鼠，经过DNA和蛋白水平检测，最终获得20％的阳性个体。4．制备携带SCDl基因的转基因羊。参照睾丸注射制备转基因小鼠的基本思路，采用睾丸注射制备转基因羊。关键词：徐淮山羊，SCDl，转基因小鼠，睾丸注射，转基因羊IIICloningofXuhuaigoatS

7、CD1gene，SubcellularLocalizationandthePreparationofTransgenicMiceandtransgenicsheepM．S．Candidate：CaiyeZhuAdvisor：Prof．LiBi．chunMajor：Animalgenetics，breedingandreproduction(CollegeofAnimalScienceandTechnology,Y粕gzllouUniversity,Yang吐ou225009)AbstractStearoyl—coenzymeAdehydrogenase

8、(SCD)isatransmembraneproteasewhichexistsintheen