孤独症模型大鼠经典wnt信号通路与氧化应激变化的研究

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1、复旦大学博士学位论文孤独症模型大鼠经典Wnt信号通路与氧化应激变化的研究姓名：张应花申请学位级别：博士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：李瑞锡2012-04复旦大学博士学位论文中文摘要孤独症模型大鼠经典Wnt信号通路与氧化应激变化的研究中文摘要孤独症(autism)又称自闭症，是一种广泛的神经发育障碍性疾病，一般于3岁前发病，严重影响儿童的语言形成、情绪认知与社会行为。多数患儿有明显的语言交流艰难、社交行为障碍、重复刻板行为三大核心临床表现。这些患儿不能正常入托、上学，甚至将来也无法工作。近年来的统计数据资料表明，autism的发病率逐年增多。Autism的病因不明，目前普遍认为是遗传和环境

2、因素在脑发育关键时期共同作用的结果。如，妊娠早期有丙戊酸盐(Valproicacid，VPA)用药史的产妇，其子代发生autism风险大大增加。非遗传因素可能与干扰胚胎脑发育的正常的信号通路传导有关，而遗传因素可能是信号通路传导异常导致的基因突变所致。‘Wnt／p．catenin信号通路对个体发育，尤其是神经系统发育有重要的调控作用。在个体发育早期，它调控神经细胞的增殖、分化、凋亡与迁移以及突触的形成与联系，调控细胞、组织及器官正常有序的分化和生长发育。然而Wnt通路犹如双刃剑，既是调控神经细胞正常分化发育的重要通路，又是神经发育疾病发生的成因之一，通路中任何蛋白分子的异常，都将引起信号传递错

3、误，导致细胞命运的改变，进而引发神经发育障碍疾病的发生，如autism。许多autism患者存在Wnt2编码序列基因突变，故Wnt2基因是autism易感基因。敲除通路中散乱蛋白(Dishevelled，Dvl)．1基因的小鼠，表现出社交行为和感觉运动障碍，说明Dvl-1基因可能参与动物社会行为的形成，这可能与Dvl．1调节神经发育有关，因为从Dvl．1敲除鼠组织培养的海马神经元树突发育异常。Dvl．1和Dvl一2缺失的小鼠，神经管闭合不全。p-catenin转基因小鼠，则能使神经前体细胞增殖，导致巨大脑、脑皮质容量增加，这可能与autism脑早期的过度增生有关。这些研究强烈提示Wnt通路与a

4、utism的发病密切相关。近年来，大量临床资料报道表明autism患者存在氧化应激的失调，如氧化应激生物标记物分泌增加，体内内源性抗氧化能力减少，能量代谢失调，线粒体功能障碍。Dickkopfl(Dkkl)是一种分泌性的Wnt抑制剂。研究显示，Dkkl转染复旦大学博士学位论文中文摘要能显著增加氧化应激产生的活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)水平。Nucleoredoxin(NIⅨ)作为一种氧化还原剂，通过与Dvl作用，对Wnt信号通路进行负调节。H202作用于细胞减少了NRX和Dvl的相互作用，导致T细胞因子(Tcellfactor，TCF)暂时激活。而与这些结果截然

5、相反的许多研究显示，H202诱导ROS依赖性的信号转导抑制了13-catenin／TCF转录活性。ROS能抑制许多磷酸酶，而H202处理后GSK3怎么去磷酸化并不清楚。有趣的是，有研究显示，Dvl高表达能改善H202诱导的13-catenin／TCF转录活性抑制。因此，这些研究提示ROS依赖于Dvl在调节Wnt信号通路中起双重作用。这也说明氧化应激与Wnt信号通路之间存在关联。那么，autism动物模型是否存在氧化应激异常?在autism产生过程中氧化应激与Wnt信号通路是否存在关联?用Wnt信号通路特异性抑制剂是否能改善autism行为学异常?目前尚不清楚。针对这些问题，本课题集中研究aut

6、ism动物模型及培养神经元中氧化应激与Wnt／13．catenin通路相关分子的关系，以探讨autism发病的相关分子机制。我们主要进行了以下三方面的工作：一、建立并检测了autism动物模型。采用Wistar大鼠，在妊娠第12．5天时，腹腔注射(Intraperitonealinjecting，ip)VPA制作子代autism大鼠模型，并运用热板致痛法、倾斜板实验、Moms水迷宫等方法对模型大鼠进行发育与行为学检测。结果显示，与正常对照组比较，autism模型组大鼠脑发育异常、睁眼时间推迟、方向趋向性机能及伤害性知觉下降、游泳能力差、重复刻板动作增加、学习记忆和空间探索能力差。这些表现与人类

7、autism患者的某些特征极为相似，表明用VPA注射法较成功地制作出了autism大鼠模型。二、研究了Wnt／13．catenin信号通路及氧化应激水平。运用Real-timePCR和Westernblot技术检测autism模型大鼠前额叶皮层(Prefrontalcortex，PFC)和海马(Hippocampus，HC)两脑区Writ通路信号蛋白GSK一3B，磷酸化GSK-3p(Phospho