硫化氢对平滑肌细胞内吞氧化型低密度脂蛋白的影响

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1、苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：苏州大学学位论文使用授权声明IIIIIHNIIIHHHHIY2122285本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有

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3、影响中文摘要目的：探讨外源性硫化氢对血管平滑肌细胞内吞氧化型低密度脂蛋白的影响，并对其分子学机制进行初步探讨，为动脉粥样硬化的防治提供新的理论依据。方法：采用组织贴块法从大鼠腹主动脉分离培养血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)。培养基选用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM，培养条件为5％C02、37。C。培养3"--'5天有细胞爬出，7～9天可进行第一次传代。实验选用3～4代VSMC。根据不同检测方法可分为：①用于MTT检测细胞活性的细胞接种于96孔板，按5x104／mL细胞密度每孔2001xl；②用于油红O染色、免疫细胞化

4、学检测的细胞接种于放有小圆玻片的24孔板内，按1x105／ml细胞密度每孔lml；③．用于免疫印迹检测的细胞接种于无菌6孔板中，按1x106／ml细胞密度，每孔2ml。实验分组：1、MTT法检测H2S对VSMC活性影响：分为对照组、NariS(25、50、100、200、500、1000扯mol／L)组；2、油红O染色检测VSMC脂质含量与免疫细胞化学法检测CD36、LOX一1受体表达：分为对照组、ox-LDL(80}tg／m1)组、ox-LDL(80pg／m1)+NaHS(501．tmol／L)组、ox-LDL(80I．tg／m1)+PPG(3mmol／L)组；3

5、、DiI-oxLDL内吞的检测：分为DiI-oxLDL(10pg／m1)组，DiI-oxLDL(10p,g／m1)+NaHS(50肛mol／L)组，DiI-oxLDL(10lag／m1)+PPG(3mmol／L)组：4、Westernblot测定VSMC的CD36、LOX一1蛋白表达：分为对照组、ox--LDL(80I-tedma)组、ox-LDL(80I．tedma)+NariS(25、50、100、200}tmol／L)组。结果：1．MTT结果显示，NaI-IS浓度在200}tmol／L以下时，对VSMC的活力没有明显影响，当NariS浓度增加到500和1000

6、1xmol／L后细胞活力明显下降。2．通过油红。染色观察外源性H2S(以NariS为供体)对VSMC脂质摄取的影响。结果发现，与对照组相比，VSMC与ox-LDL单独孵育后胞内脂质显著增多，当用中文摘要硫化氢对血管平滑肌细胞内吞氧化型低密度脂蛋白的影响及机制CSE(胱硫醚吖兹f解酶)抑制剂PPG作用后，脂质沉积更明显，而H2s处理后的VSMC胞内脂质明显减少。3．用DiI-oxLDL处理VSMC，Confocal观察VSMC对ox-LDL的内吞作用，主要观察外加DiI-oxLDL在VSMC胞内’的积聚。结果观察到H2S能抑制VSMC对ox-LDL的内吞，而PPG则增

7、强这种内吞作用，与油红。染色结果相符。4．免疫细胞化学法检测VSMC的CD36、LOX一1受体表达，对H2S抑制VSMC内吞ox-LDL的分子学机制进行初步探讨。结果显示，ox-LDL能明显诱导VSMC的CD36、LOX一1受体表达，H2S处理后可下调这两种受体的表达，PPG作用后则使CD36、LOX-1受体表达上调。5．为进一步确定H2S抑制VSMC内吞脂质的机制是否与其下调CD36、LOX一1有关，本实验还采用了Westernblot方法分析NariS对VSMC的CD36、LOX一1蛋白表达的影响。结果发现，ox-LDL显著增强诱导VSMC的CD36、LOX